冠心病(coronary heart disease,CHD),即冠状动脉硬化性心脏病,是指因冠状动脉粥样硬化或(和)功能性改变(狭窄)导致血管狭窄或闭塞,而引起心肌缺血、缺氧所导致的心脏疾病,又称缺血性心脏病。丹参饮,出自清代陈修园《时方妙用》,现代临床常用于治疗冠心病心绞痛,效果显著。近年实验研究发现丹参饮具有抗心肌纤维化、抗细胞凋亡、抗凝血、影响心肌酶、降低炎症因子水平、减轻心肌缺血损伤等作用,对于其具体的心肌保护作用机制仍然还有很多未知,需要不断的实验探索。本课题尝试从多角度、不同水平评价丹参饮提取物(Danshen Yin’s extracts,DSYE)对心肌缺血损伤模型大鼠的保护作用并探索其可能的作用机制。目的:1.构建大鼠心肌缺血损伤的动物模型,观察DSYE对缺血心肌的血清心肌酶水平、心肌梗死的面积以及心肌病理形态学变化的影响,评价其对缺血心肌的保护作用。2.观察DSYE对心肌组织氧化应激及PI3K-Akt信号通路的影响,探讨其保护缺血心肌的作用机制。方法:采用冠脉结扎手术制备心肌缺血损伤大鼠模型,其中假手术组(sham组)仅穿线不结扎。将造模成功的大鼠随机分成六组,即模型组、复方丹参滴丸组、尼可地尔组、DSYE低剂量组、DSYE中剂量组、DSYE高剂量组,每组10只。每组灌胃给予相应药物,每天一次,共30天;假手术组则每天给予同体积的纯净水。最后一次给药2h后,麻醉大鼠以监测大鼠动态心电图(ECG),随后腹主动脉采血收集大鼠血液标本,最后迅速开胸取出大鼠心脏,全自动生化分析仪检测大鼠血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)含量,光镜和电镜下分别观察大鼠心肌组织的病理学变化及心肌细胞超微结构改变情况,采用TUNEL法测定心肌细胞凋亡情况,生化法检测大鼠心肌超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)的含量,免疫组化法检测Bax/Bcl-2蛋白在心肌组织的表达,免疫印迹法(Western blot,WB)检测心肌组织Akt、P-Akt、GSK-3β、P-GSK-3β、Caspase-3等蛋白的表达。结果:1.血清心肌酶含量:模型组大鼠CK-MB、LDH含量均较假手术组显著升高(P<0.01),DSYE低、中、高剂量组的CK-MB和LDH活性均较模型组有所降低,且中、高剂量组有统计学意义(P<0.05)。2.心肌缺血梗死面积:与模型组比较,DSYE中、高剂量组大鼠心肌缺血梗死面积均有所减小,差异有统计学意义(P<0.05);DSYE低剂量组能一定程度上减小缺血心肌的梗死面积,但没有统计学意义(P>0.05)。3.心肌组织病理形态变化:与假手术组比较,模型组大鼠心肌纤维化变性、肿胀、坏死,毛细血管扩张以及炎性细胞浸润严重,甚至部分出现心肌凝固性坏死、心肌空泡变及炎性反应灶;与模型组比较,DSYE中、高剂量组的心肌组织纤维化、肿胀和坏死程度均减弱,炎性细胞浸润减轻,未出现炎性反应灶及心肌空泡坏死。4.心肌超微结构的变化:假手术组大鼠的心肌细胞形态良好,线粒体结构完整;心肌纤维排列有序。模型组大鼠的心肌线粒体肿胀呈空泡状,甚至溶解;心肌纤维排列变得紊乱,细胞间质中出现胶原纤维沉积,说明心肌细胞结构受损比较严重。DSYE低剂量组心肌细胞受损未见明显减轻。DSYE中、高剂量组心肌细胞受损减轻,细胞核基本完整呈椭圆形,线粒体的肿胀明显减轻。5.心肌细胞凋亡指数:与假手术组相比较,模型组大鼠心肌细胞凋亡指数显著升高(P<0.01)。与模型组相比较(P<0.01),DSYE低剂量组凋亡指数有所降低,没有统计学意义(P>0.05);DSYE中、高剂量组凋亡指数明显降低(P<0.01 或 P<0.05)。6.心肌组织中氧化应激水平:与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中SOD和GSH-Px活力显著性降低(P<0.01)、MDA含量显著升高(P<0.01);与模型组比较,DSYE低、高剂量组GSH-Px活力明显升高(P<0.05或P<0.01);DSYE中、高剂量SOD活力明显升高(P<0.05或P<0.01);DSYE低、中、高剂量MDA含量均显著降低(P<0.01)。7.PI3K-Akt信号通路:免疫组化结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织的凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达水平显著升高,而抑凋亡蛋白Bcl-2的表达水平显著降低(P<0.01);与模型组比较,DSYE低、中、高剂量组Bax、Caspase-3蛋白的表达水平均有降低(P<0.05或P<0.01),且Bcl-2蛋白显著升高(P<0.01)。WB检测结果显示,各组大鼠心肌总Akt、GSK-3β蛋白表达差异无统计学意义;模型组P-Akt、P-GSK-3β蛋白的表达较假手术组显著降低(P<0.05或P<0.01);DSYE中、高剂量组P-Akt、P-GSK-3β蛋白的表达较模型组明显增加(P<0.05)。结论:1.DSYE可降低心肌缺血损伤模型大鼠的血清心肌酶水平、减少心肌梗死面积,从而发挥对心脏的保护功能,且其对心肌损伤的保护作用呈剂量依赖性。2.DSYE能够改善心肌病理形态及心肌细胞超微结构的变化,降低缺血心肌细胞凋亡指数,提示其具有保护受损心肌、抑制心肌细胞凋亡的作用。3.DSYE能够增加心肌内氧自由基清除酶SOD、GSH-Px的活力,降低过氧化产物MDA的含量,提示其能够抑制氧化应激反应,这可能是其减轻心肌细胞损伤的原因之一。4.DSYE可增加抑凋亡蛋白Bcl-2的表达,降低促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达,这可能是其抑制心肌细胞凋亡的原因之一。5.DSYE可增加Akt和GSK-3β蛋白的磷酸化水平。磷酸化的Akt可使Bad蛋白磷酸化并与Bcl-XL分离,恢复Bcl-XL对促凋亡蛋白Bax/Bak的抑制作用;Akt磷酸化还能够增加p-GSK-3β的活性,减少Ca2+进入线粒体和ROS的生成。因此,结果提示DSYE可能通过影响PI3K-Akt信号通路而维持线粒体结构与功能的完整并调控凋亡蛋白相关基因的表达,这可能是其保护缺血心肌作用的分子机制。综上所述,我们的结果提示DSYE对心肌缺血大鼠模型具有降低血清心肌酶水平、减少心肌梗死面积、改善心肌病理形态和心肌细胞超微结构以及抑制心肌细胞凋亡等作用,其作用机制可能与抑制氧化应激并通过影响PI3K-Akt信号通路而减少心肌细胞损伤和细胞凋亡有关。