蒙药白脉散组分库的建立和神经保护有效成分组的研究

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缺血性脑卒中严重危害人类健康,神经病变是其特征之一,临床缺乏理想药物,神经保护剂的研究具有重要意义。脑卒中属于蒙医“白脉病”的范畴,蒙医在数千年临床实践的基础上积累了大量宝贵的用药经验。其中,白脉散为治疗缺血性脑卒中的经典蒙药复方,亟待发掘和研究。  本论文以“有效成分组”理论为指导,以蒙药白脉散为研究对象,以获得白脉散有效成分组为研究方向,采用快速制备技术和活性组分快速筛选方法,获得白脉散神经保护活性组分,并在分子和细胞水平研究其活性和作用机制。  采用水提醇沉法制备白脉散提取组分2个,采用溶剂萃取法制备白脉散溶剂分配组分4个,创新性采用闪式柱色谱线性梯度洗脱法划段分离,制备白脉散色谱组分69个,从而获得白脉散全组分,构建了白脉散组分库。采用高效液相色谱法评价闪式柱色谱分离效果,结果显示,闪式柱色谱依照物质在加压条件下与硅胶吸附力的不同,对复方提取物进行了有效分离与富集,各组分相对简化,可用于活性筛选。采用高效液相色谱法对组分进行色谱表征、结合对照品确定复方中部分活性成分的分布情况。  采用二苯代苦味肼基自由基(DPPH)法建立抗氧化活性的高通量筛选模型,对复方全组分进行筛选。组分F2-5~F2-18清除自由基活性高于阳性药依达拉奉,可能为复方抗氧化活性组分,其中F2-5的主要成分为没食子酸。  建立原代神经元缺糖缺氧复供(oxygen-glucose deprivation andreperfusion,OGD/R)损伤模型,对复方全组分进行神经保护活性筛选,组分F2-12~F2-21、F3-51~F3-53、F5活性高于阳性药银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract,EGb),可能为复方神经保护活性组分。组分F1、F2-1、F3-56、F4-57~F4-69和F6显示毒性。高效液相色谱分析表明,组分F2-15为含有多种成分的复合物,其良好的体外神经保护活性可能与其多成分配比有关。  综合以上筛选结果,组分F2-15、F2-52、F5同时具有较高的自由基清除活性和对缺糖缺氧神经元的保护活性,提示其属于蒙药白脉散有效成分组的组成部分。  对实验所得活性最好的组分F2-15进行神经保护机制研究。F2-15在30~70μg/mL范围内具有神经保护活性,在40μg/mL时活性最高,可显著抑制OGD/R损伤引起的神经元严重损伤,使细胞活力提高、乳酸脱氢酶漏出减少、细胞形态得到改善、凋亡与坏死细减少。实验显示,F2-15可降低胞内瞬时钙超载和活性氧水平,抑制线粒体膜电位下降,通过降低促凋亡蛋白Bax和凋亡执行蛋白Caspase-3的表达抑制细胞凋亡,从而作用于钙超载-线粒体-凋亡的神经元损伤通路各个环节,从而对神经元发挥保护作用。  此外,本课题采用与白脉散复方相同的方法,对白脉散的主药诃子进行了组分制备与活性筛选,获得诃子提取组分2个,溶剂分配组分3个,色谱组分60个,构建了诃子组分库,其中,组分HZ2-71~HZ2-91、HZ2-93~HZ2-96、HZ3-98~HZ3-106、HZ3-109~HZ3-117、HZ4-119、HZ4-126为抗氧化活性组分;组分HZ2-79~84为神经保护活性组分。HZ2-80是兼具强抗氧化活性与神经保护活性的诃子代表性组分。实验结果表明,诃子在蒙药白脉散抗脑缺血神经病变方面应起到重要作用,诃子的某些成分应属于白脉散有效成分组的部分组分。  综上所述,本实验创新性地将闪式柱色谱分离技术与体外筛选技术相结合,用于民族大复方的研究,具有可行性与快速、有效性。发现了白脉散的体外抗脑卒中神经病变有效组分,并验证其代表性组分F2-15通过作用于神经元钙超载-线粒体-凋亡通路发挥神经保护作用。课题一方面为民族药物白脉散的开发提供关键实验数据,一方面为民族大复方药效物质基础研究提供一种新思路和新方法,可推广应用于类似研究领域。
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