类人胶原蛋白Ⅰ的分离纯化及其功能特性的研究

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本文对类人胶原蛋白I(HCB I)的分离纯化及其功能特性进行了研究。收集基因工程菌Escherichia coli BL 21高密度发酵后的菌体,经高压匀浆破碎、沉淀、超滤、离子交换层析后,得到高纯度的目标蛋白。在细胞破碎阶段,对高压匀浆过程中的物理和化学因素:包括匀浆压力,匀浆次数,菌体浓度,悬浮体系做了系统研究。确定工艺为:菌体浓度15%,蒸馏水悬浮,在80MPa压力下连续高压匀浆两次,每次通过匀浆机的裂解液用冰浴冷却。在沉淀阶段,采用L16(45)正交表进行实验,确定沉淀的最佳参数为:pH值2.8,NaCl浓度3%,温度18℃,蛋白浓度5g·L-1。在超滤阶段,采用截留分子量为30kD的超滤膜包对沉淀后的上清进行超滤,通过多次实验确定参数为:进料浓度为0.2%,操作压力为0.3MPa,进料流量为3 L·min-1,温度为25℃,pH值为3。在层析阶段,先用CM-1吸附杂蛋白,上样浓度为4mg·mL-1,吸附时间为1h,缓冲液为pH值为6.5、浓度为20mmol·L-1。的磷酸盐缓冲液,内含0.03 mol·L-1的NaCl;再用Fracogel EMD DEAE吸附目标蛋白,上样浓度为4mg·mL-1,缓冲液为pH8.0、50 mmol·L-1的Tris-HCl溶液,以3.0 mL·min-1的流速过柱吸附,采用逐次洗脱方法洗脱。最终得到纯度为96.8%的类人胶原蛋白Ⅰ,回收率为80.47%。经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳并以考马斯亮蓝G-250染色后得一单带。参照文献方法测定了类人胶原蛋白Ⅰ的溶解性、吸水性、保水性、湿润性、吸油性、乳化性质及起泡性和泡沫稳定性,并与分子量相近的明胶的相关特性进行对比。结果表明:类人胶原蛋白Ⅰ具有良好的溶解性、吸水性、湿润性、吸油性、乳化和乳化稳定性、起泡性和泡沫稳定性及一定的保水性。
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