手足口病(hand-foot-and-mouthdiseaseHFMD)的发病率和病死率位居我国丙类传染病首位,严重危害我国婴幼儿的生命健康。A型肠道病毒Enterovirus 71(EV71)和Coxsackievirus A16(CA16)被认为是诱发HFMD的主要病原体,因此研制EV71和CA16双价疫苗对于预防HFMD刻不容缓。目前EV71灭活疫苗已研制成功,但是CA16灭活疫苗的研制至今尚未获得突破。EV71和CA16均具有类似的正二十面体的病毒结构特征,但是在疫苗研制中却存在截然不同的难度,其显著区别是CA16灭活疫苗不仅诱导中和抗体的能力远远低于EV71,而且CA16空心病毒颗粒无法诱导机体产生中和抗体。相关研究提示可能是两种病毒的中和表位的分布和结构特征存在显著区别,进而影响了疫苗的研制效果。为证实这一假设,本研究拟通过表位鉴定和结构模拟,分析EV71和CA16两种病毒的表位分布及结构特征的区别,以期解释EV71和CA16两种疫苗的研制难度。第一,EV71-C4基因型病毒的免疫优势构象性中和表位的发现及其关键氨基酸位点的定位。首先,建立稳定可靠的单抗与血清相互阻断实验体系,并利用实验室前期鉴定的EV71-C4构象性中和表位Site A,Site B,Site C的相应中和单抗与EV71小鼠免疫血清、感染EV71患者血清进行阻断研究,结果显示,识别Site B的中和单抗均能够对上述血清产生优势阻断效果,提示Site B是EV71-C4基因型病毒衣壳蛋白表面具有免疫优势的广谱构象性中和表位;其次,用两株Site B表位关键氨基酸位点突变的逃逸病毒免疫小鼠的血清对EV71各基因型病毒进行体外中和实验,结果发现,VP3-S64的突变为I64导致了病毒的免疫血清对EV71部分基因型病毒中和能力明显降低,提示VP3-S64是EV71-C4病毒衣壳蛋白表面决定病毒诱导广谱中和抗体的关键氨基酸位点,从而进一步证明了 SiteB是EV71-C4基因型病毒的关键的免疫优势构象性广谱中和表位。第二,CA16中和单抗库的构建以及CA16中和表位的定位研究。首先,利用分子进化分析方法,从实验室常用的9株CA16病毒中选择毒株190-TW-2007作为免疫原,制备出41株特异性中和CA16的单抗,并对中和单抗进行了全面的性质鉴定,发现大量构象性中和单抗;其次,用9株CA16代表性病毒株对挑选出的22株代表性单抗的中和反应谱进行鉴定,构建CA16中和单抗盘;进一步,构建适用于CA16表位鉴定的逃逸病毒筛选平台,并利用该平台对CA16中和单抗盘中的22株单抗的识别表位进行鉴定;最后,结合氨基酸位点与单抗的对应关系,并根据同源建模获得的病毒颗粒表面氨基酸的位点分布,确定了 CA16的两个主要的构象性中和表位,Site α(VP1-E213、L215、A217、N218、L220、D292、K293;VP3—K59、N141)和 Site β(VP1—N282;VP2—K69、S70、V159、S230;VP3—V75,S77,K78)。第三,CA16和EV71构象性中和表位的分布及结构特征的比较分析。首先,分别对CA16的实心和空心病毒颗粒进行同源建模,发现CA16构象性中和表位Site α和Site β的空间结构在实心和空心颗粒状态下有明显不同;然后,对EV71进行同源建模,发现EV71构象性中和表位Site C和优势表位Site B的空间结构在实心和空心颗粒状态下几乎没有不同,仅Site A表位分布发生微小的偏移。上述结果提示EV71的构象性中和表位对病毒颗粒的构象依赖性远低于CA16,因此EV71灭活疫苗中的实心颗粒与空心颗粒均可有效诱导机体产生中和单抗,而CA16灭活疫苗中的空心病毒颗粒由于构象性中和表位的结构相比实心病毒颗粒发生较大改变,导致CA16疫苗中的空心颗粒成分无法有效诱导机体产生中和抗体,大大降低CA16疫苗诱导保护性抗体的能力。上述结果阐明了 EV71和CA16在构象性中和表位的定位、组成以及结构特征的差异,一定程度上解释了 EV71和CA16两种疫苗研制的难度区别,为疫苗的后期研究提供了重要的理论基础。