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目的:利用新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemicbraindamage,HIBD)动物模型,观察缺氧缺血性脑损伤后新生大鼠不同时间点脑神经元细胞形态变化、Fas和FasL蛋白的合成,并探讨二者间的关系,为临床新生儿缺氧缺血性脑病的预防和治疗提供实验和理论依据。
方法:1.制备新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemicbraindamage,HIBD)动物模型。2.行为能力的检查:分别于术前和术后及缺氧时观察每只新生大鼠的行为变化。3.将7日龄Wistar大鼠128只,雌雄不限,体重11~19g,随机分为:正常对照组(16只):不做任何处理;假手术组(16只):游离左侧颈总动脉后不结扎,直接缝合皮下组织及皮肤,不进行缺氧处理;缺氧缺血组(HIBD)(96只):采用阻断左侧颈总动脉后置于低氧环境中2小时,建立缺氧缺血性脑损伤动物模型并对其行为进行观察。HIBD组于6h、12h、24h、48h、72h、7d各处死16只,灌注固定后取脑组织常规石蜡包埋、切片,HE染色观察神经元细胞形态变化,免疫组织化学染色法(SP法)检测三组大鼠不同时间点Fas及FasL在大脑皮层的神经元细胞中的表达。采用BI-2000医学图像分析系统进行图像采集与分析,每张切片随机选取5个高倍视野(×400),根据染色强度测定阳性信号灰度。用SPSS13.0统计分析软件进行数据分析,P<0.05表示差异有统计学意义。
结果:1.神经系统功能改变:正常对照组及假手术组无明显神经系统异常改变,HIBD组在缺氧1~5分钟后均出现激惹、翻身不能、平衡异常、夹尾尖叫甚至抽搐等异常行为改变。2.HE染色:缺氧缺血后6h左侧脑神经元细胞水中及少量局灶性坏死,缺氧缺血后72h左侧脑皮质的神经元细胞中可见界限清楚的坏死灶。3.Fas的表达变化:正常对照组及假手术组偶可见Fas在大脑皮质神经元细胞胞浆表达;HIBD组可见较多的大脑皮质神经元细胞胞浆Fas表达阳性细胞,6h开始升高,24h明显增多,于72h达高峰,图像灰度分析示灰度值组间差异具有统计学意义(P<0.05)。4.FasL的表达变化:正常对照组和假手术组FasL在脑神经元细胞胞浆少量表达,细胞核无明显表达;HIBD组FasL表达在脑神经元细胞胞浆6h后开始升高,48h~72h达高峰,至7天仍可见免疫反应阳性细胞,图像灰度分析示灰度值组间差异具有统计学意义(P<0.05)。5.Fas和FasL表达水平的相关性分析,结果示缺氧缺血性脑损伤后Fas蛋白表达水平与FasL蛋白表达水平呈正相关系,相关系数(r=0.8818)。
结论:1.在HIBD后6h,Fas的合成在脑神经元细胞胞浆开始逐渐增多,于72h达高峰,随着其增多FasL蛋白表达也逐渐增多于72h达高峰,Fas的蛋白表达先于FasL,且通过直线相关分析两者的表达呈正相关关系,2.初步推断Fas蛋白的活化可以上调FasL蛋白的表达。3.Fas/FasL与脑细胞凋亡有直接关系,是HIBD的发病机制之一。4.另外在实验结果中,我们观察到脑损伤后随着时间的推移,显示Fas/FasL参与凋亡的作用时间较早。5.说明Fas/FasL蛋白表达对早期干预HIBD有实际意义。