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肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducingligand，TRAIL)与TNF-α和Fas-L类似，是肿瘤坏死因子家族TNF的成员之一，但具有比后两者更广的抗癌谱。TRAIL可与死亡受体特异性结合引起肿瘤细胞凋亡，但对正常细胞无明显影响，且不会产生严重的炎症反应，是肿瘤药物研究的热点，然而，TRAIL在体内的半衰期较短，严重影响了其体内疗效。将人IgG1Fc片段与目的蛋白片段进行融合表达已用于增加目的蛋白的半衰期，并可减少TRAIL可能带来的肝细胞毒性，是理想的增强TRAIL半衰期和安全性的手段。研究目的：本研究利用大肠杆菌分泌表达系统重组表达含不同连接肽的重组TRAIL-Fc融合蛋白，通过摇瓶表达、鉴定筛选结构稳定的连接肽，确定候选的TRAIL-Fc融合蛋白结构。在此基础上，筛选高表达的工程菌株、优化发酵条件及纯化工艺、得到高纯度TRAIL-Fc融合蛋白，进行结构确定和体内外活性测定，确定最终结构的TRAIL-Fc融合蛋白，为进一步研发肿瘤药物奠定基础。研究方法：①设计并构建含不同连接肽的重组表达质粒pET-22b-TRAIL-Fc，并分别采用CaCl2法转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)plysS。②利用IPTG进行诱导表达重组TRAIL-Fc融合蛋白，通过SDS-PAGE电泳、液质联用LC-MS检测并筛选蛋白结构稳定且高表达、不易在Hinge处断裂的蛋白结构，并进行30L发酵培养。③对TRAIL-Fc融合蛋白纯化工艺进行研究，利用Q离子交换层析柱、Protein A亲和层析柱、CM离子交换层析柱纯化目的蛋白，并对目的蛋白进行结构确认研究。④采用MTT法检测TRAIL-Fc融合蛋白体外对多株肿瘤细胞的生长抑制作用，建立H22小鼠肝癌模型，检测TRAIL-Fc融合蛋白对体内肿瘤细胞生长抑制作用，研究TRAIL-Fc融合蛋白体内外的生物学活性。研究结果：①经双酶切及测序鉴定，成功的构建了重组质粒pET-22b-TRAIL-Fc-L1、pET-22b-TRAIL-Fc-L2、pET-22b-TRAIL-Fc-L3和pET-22b-TRAIL-Fc-L4，并成功转化至E.coli BL21(DE3)plysS。②经SDS-PAGE电泳、液质联用LC-MS检测，重组TRAIL-Fc-L3、TRAIL-Fc-L4融合蛋白的结构较稳定，不易于Hinge区发生断裂。③纯化回收发酵表达样品，成功获得重组融合蛋白TRAIL-Fc-L3、TRAIL-Fc-L4，纯度达到95%以上，经SDS-PAGE电泳、质谱测定和Western Blot分析证明TRAIL-Fc-L3、TRAIL-Fc-L4的分子量、C端和N端与理论相符，表达的目的蛋白结构正确。④体外细胞活性测定表明TRAIL-Fc-L3对各种肿瘤细胞生长的抑制作用更明显，且TRAIL-Fc-L3对TRAIL对照品不敏感的肿瘤细胞更为敏感。体内活性测定表明TRAIL-Fc-L3能明显抑制肿瘤细胞的生长并对小鼠肝功能无毒副作用，同时TRAIL与Fc片段的融合蛋白的半衰期明显提高，三天给药一次即可起到较好的效果。