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NAP (NAC-Like, Activated by AP3/PI)是转录因子NAC家族中一个重要成员,简称NAP亚家族。NAP亚家族是植物所特有的转录因子,其在调控植物生长发育、响应外界环境胁迫以及控制叶片衰老等方面有着重要的作用,尤其可以通过调控叶片衰老进而影响植物的产量和品质,这已引起科研工作者的关注。然而目前有关NAP亚家族的研究主要集中在拟南芥和水稻这些模式植物上,在非模式植物如棉花上的研究较少。棉花是一种重要的经济作物,在国民经济中占有重要的地位,但有关NAP成员在棉花上的相关研究还未见深入的报道。因此本研究以NAP亚家族为切入点,首先对玉米以及其他植物中的NAP成员进行研究,进而推广到棉花这一非模式植物上,并对陆地棉中一个NAP成员(GhNAP)与叶片衰老相关的功能及其调控机制进行深入探究,全方位阐明GhNAP的系统发育进程、结构特点以及调控叶片衰老的功能。研究的主要结果如下：1.利用古多倍体植物玉米的基因组数据库,分离到124个NAC成员,进一步将其划分为13个NAC亚家族。全基因组复制事件尤其是额外的全基因组复制事件可能在ZmNAC扩增中具有重要的作用。不同的亚家族有不同的扩增速率,ZmNAC家族的扩增集中出现在一些NAC亚家族中。另外,玉米的复制事件可能发生在玉米和谷子这两个物种分化以后,并且片段复制事件在玉米的基因复制事件中扮演着重要的作用。ZmNAC的扩增也与内含子的获得和缺失有关。在基因复制以后,复制基因发生了有限的功能分化。此外,玉米的NAP亚家族包含较少的成员,未发生任何基因复制事件,并且其基因结构以及内含子相位相对保守,同时玉米中NAP成员的功能与其他植物中NAP成员的功能类似,这表明NAP成员的结构和功能在玉米中可能是相对保守的。2.通过对39种植物的全基因组进行分析,发现197个NAP成员分布在31种维管束植物中,而在8种非维管束植物中并未发现NAP成员的存在。所有的NAP成员可以在进化上分为两组(NAP Ⅰ和NAP Ⅱ),并且NAP Ⅰ的起源时间可能晚于NAP Ⅱ的起源时间。在物种分化以后,物种内的基因复制尤其是片段复制事件可能导致了NAP成员的扩增,而且该扩增还与内含子的获得和缺失有关。另外,在基因复制以后功能分化是有限的,同时也发现ABA在NAP亚家族调控的叶片衰老过程中可能发挥着很重要的作用。3.在棉花中,采用电子克隆和传统PCR克隆相结合的方法克隆出了与拟南芥AtNAP同源的NAP亚家族成员GhNAP,结果发现GhNAP具有典型的NAP亚家族结构特点,即GhNAP包含相对保守的NAC区,并且可以进一步分为5个不同的亚区(A到E),同时其TAR区包含一个相对保守的NAP Ⅰ亚区。另外,对GhNAP在植物界中的进化进行分析,发现GhNAP与拟南芥AtNAP聚在一个分枝上,都属于NAP Ⅰ组成员。通过互补实验发现GhNAP可以互补拟南芥atnap突变体的滞绿表型,这表明陆地棉中的GhNAP是拟南芥AtNAP的一个直系同源基因。4.基因多拷贝现象在棉花中经常存在,本研究发现GhNAP具有四个拷贝(GhNAP_a、GhNAP_b、GhNAP_c和GhNAP_d),每一个拷贝都包括三个外显子和两个内含子；并且GhNAP_a和GhNAP_b可能来源于A基因组祖先棉种,而GhNAP_c和GhNAP_d可能来源于D基因组祖先棉种；同时NAP成员在陆地棉中的数目扩增是在种间杂交以后发生的,并非在祖先种中发生。此外,通过序列比对以及分化时间的分析发现,在GhNAP中,A亚基因组的拷贝更易转变成D亚基因组的拷贝。对其功能进行初步分析发现,GhNAP的功能与目前较为接近的祖先棉种(亚洲棉和雷蒙德氏棉)中的NAP成员功能类似,但不同拷贝之间可能出现了一些功能的分化现象。5.异位表达实验表明,过表达GhNAP可以引起拟南芥叶片早衰,但在转GhNAPi株系中,其叶片衰老现象得到适当的延缓；在棉花中,降低GhNAP的正常表达可以适当延缓叶片衰老。相似的现象也出现在黑暗诱导叶片衰老的实验中。因此,GhNAP可以在棉花中成为一个指示棉花叶片衰老进程的衰老标记基因,同时在自然和黑暗环境下GhNAP在叶片衰老中均起着重要的作用。此外,在棉花中降低GhNAP的正常表达可以延缓叶片衰老,进而对棉花的产量和品质产生影响。6. GhNAP具有转录激活活性,其转录激活区域主要位于GhNAP中相对多样化的TAR区。另外,GhNAP的亚细胞定位在细胞核处,这些结果表明GhNAP可能以转录因子的角色调控叶片衰老。通过对其启动子、外源ABA响应、内源ABA含量以及ABA相关基因表达的分析,发现在GhNAP调控叶片衰老过程中,ABA发挥着重要的作用。酵母单杂交实验发现GhNAP的直接下游靶基因不是GhSAG113,这表明在调控叶片衰老中,棉花GhNAP以一种不同于拟南芥AtNAP的调控模式调控叶片衰老。综上所述,本研究利用比较基因组学的方法对玉米以及其他植物中的NAP成员进行分析,发现NAP亚家族在植物界中的结构和功能具有一定的保守性。在此基础上,从陆地棉中克隆出一个NAP Ⅰ组成员GhNAP,发现GhNAP在陆地棉中具有多拷贝现象,同时GhNAP可以通过ABA介导途径以一种不同于拟南芥AtNAP的调控模式来调控叶片衰老,进而影响棉花的产量和品质。这些结果不仅对陆地棉的进化历程和NAP亚家族调控叶片衰老相关机制的研究起到一定的推动作用,同时也为其他植物尤其是多倍体植物的育种提供了一个具有潜在育种价值的候选基因。