论文部分内容阅读
苯作为一种重要的化工原料,广泛应用于工农业生产多个领域。长期接触苯可引起人体出现外周血细胞减少、再生障碍性贫血甚至各种类型的白血病等血液毒性。以往研究苯的毒性作用主要集中于苯及其代谢物能诱导细胞凋亡,引起DNA损伤等方面,但是实际生活中人类接触环境污染物是长期低剂量的,较低浓度的苯及苯代谢物可能对细胞凋亡及DNA损伤并不明显。在这种浓度下苯及苯代谢物会对人体健康产生什么危害呢?本实验首先选择对细胞凋亡和存活影响比较小的氢醌和苯酚浓度建立细胞模型,然后在该模型基础上进一步观察这些浓度苯的代谢物氢醌和苯酚处理较长时间(96h)后对HL-60细胞增殖、细胞周期以及分化的影响。我们前期研究发现苯中毒工人外周血中编码LTB4水解酶的基因CYP4F3表达上调,本实验中我们还检测了这些浓度作用下CYP4F3基因及细胞培养上清中LTB4的表达变化,同时还对该过程中MAPK信号通路变化进行了初步研究,期望能找到苯中毒过程中早期的,具有预警作用的生物标志物。一.低浓度苯代谢物对HL-60细胞增殖、凋亡和分化的影响目的：探讨不同浓度苯代谢物氢醌和苯酚处理人急性早幼粒细胞株HL-60细胞96小时后细胞凋亡、存活率的变化,选择对HL-60细胞凋亡和存活没有明显影响的较低浓度来观察低浓度氢醌和苯酚对HL-60细胞增殖、细胞周期、分化的影响。材料和方法：利用AnnexinV-FITC/Propidium Iodine凋亡检测试剂盒,采用流式细胞仪检测分析不同浓度氢醌和苯酚对HL-60细胞凋亡情况的影响；利用CCK-8检测试剂盒检测不同浓度氢醌和苯酚对HL-60细胞存活率的影响；采用PI染色流式细胞术检测低浓度氢醌和苯酚对HL-60细胞细胞周期的影响；采用EDU染色荧光显微镜下观察低浓度氢醌和苯酚对HL-60细胞增殖的影响；采用CD11b标记流式检测低浓度氢醌和苯酚对HL-60细胞分化的影响。结果：(1)Annexin V/PI双染法流式检测显示和对照组相比较,35μmol/1、50μmol/1 HQ和10mmol/1 PhOH诱导细胞凋亡明显增加(P<0.05),而低浓度氢醌(15μmol/1、25μmol/1)和苯酚(100μmol/1、1mmol/1)虽然也引起细胞出现凋亡,但与对照组相比差异不明显。(2)CCK-8检测结果显示当HQ和PhOH浓度较低时(HQ浓度为15μmol/1、25μmol/1, PhOH浓度为100μmol/l、1mmol/1)细胞存活率反而增加,而当二者浓度较高时(HQ浓度为35μmol/1、50μmol/1, PhOH浓度为10mmol/1)细胞存活率与对照相比明显下降。(3)细胞周期检测结果显示在HQ和PhOH浓度较低的情况下细胞增殖增加,细胞由G1期进入S期的数量较对照明显增多。(4)EDU检测结果显示低浓度HQ和PhOH均诱导细胞DNA复制增加。(5)HQ (15μmol/1、25μmol/1)处理HL-60细胞96h后细胞表面分化抗原CD11b的表达与对照相比并没有明显增加,而PhOH (100μmol/1、1mmol/1)处理HL-60细胞96 h后细胞表面分化抗原CD11b的表达与对照相比明显增加。二.低浓度苯代谢物作用于HL-60细胞后CYP4F3基因和LTB4的变化及MAPK信号转导机制研究目的：观察并探讨低浓度氢醌和苯酚处理HL-60细胞后CYP4F3基因及LTB4的表达变化,并探讨该过程中MAPK信号通路的变化情况。材料与方法：使用荧光定量PCR技术检测低浓度氢醌和苯酚处理HL-60细胞、成人外周血单个核细胞CYP4F3基因的表达情况；使用ELISA方法检测低浓度氢醌和苯酚处理HL-60细胞后细胞上清中LTB4的含量变化；使用Western Blotting法检测P38, P-P38, ERK, P-ERK蛋白的表达情况。结果：(1)苯酚(100μmol/1、1mmol/1)、全反式维甲酸(0.001mol/1)处理HL-60细胞96h后CYP4F3基因的表达与对照相比明显增高,成人外周血单个核细胞中该基因的表达也处于较高水平。(2)苯酚(100μmol/1、1mmol/1)处理HL-60细胞96h后细胞上清中LTB4的含量下降明显,而氢醌(15μmol/1、25μmol/1)处理HL-60细胞96h后细胞上清中LTB4的含量没有明显变化。(3)HQ (15μmol/1、25μmol/1), PhOH (100mol1、1mmol/1)作用HL-60细胞96小时后P38磷酸化过程明显被增强,并且PhOH(100μmol/1、1mmol/1)对LTB4引起的P38磷酸化有抑制作用。(4)HQ (15μmol/1、25μmol/1)作用HL-60细胞96小时后ERK磷酸化过程没有明显变化,PhOH (100μmol/1、1mmol/1)作用HL-60细胞96小时后ERK磷酸化过程明显被增强,并且对LTB4引起的ERK的磷酸化过程没有明显影响。结论1.低浓度苯酚能明显促进HL-60细胞分化,低浓度氢醌对HL-60细胞的分化影响不大。2.低浓度苯酚处理HL-60细胞96小时能诱导CYP4F3基因的表达,并且能降低细胞上清中LTB4的含量。3.低浓度氢醌处理HL-60细胞96小时促进P38磷酸化,低浓度苯酚对P38和ERK磷酸化过程均有促进作用。