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奶牛是我国重要的产乳经济动物之一,奶牛乳腺泌乳功能会影响乳产量和乳蛋白的含量。蛋白质组学中一个重要的研究部分是蛋白质的翻译后修饰,而其中以磷酸化修饰最普遍、最重要,参与生命活动的整个过程。有些蛋白可以通过磷酸化和去磷酸化,调节乳蛋白、乳脂等的合成,例如mTOR和STAT5。但有关于这方面的研究很少,具体机制尚不清楚。本研究利用蛋白质质谱分析手段,鉴定了DCMECs细胞核中的磷酸化蛋白质,通过对蛋白质功能和磷酸化位点的分析,可以对磷酸化蛋白是如何影响乳合成的分子机制有更进一步的了解。并由已知的生物学手段,验证部分获得的蛋白,结果证明这些蛋白确实对泌乳过程有影响。为从蛋白质组角度研究奶牛泌乳调控的方法提供了理论依据。本实验分为二个部分：一、通过培养体外奶牛乳腺上皮细胞系,提取奶牛乳腺上皮细胞核蛋白,用质谱技术鉴定细胞核中蛋白质和磷酸化蛋白质,利用iniprot_Bos_taurus.fasta数据库,匹配有意义的蛋白质(Total score>65, P<0.05),检测到细胞核中蛋白664个、磷酸化蛋白658个,并得到了600个数据库中未知的蛋白质磷酸化位点(已提交Swissprot数据库)。二、通过RT-PCR、Western blotting和激光共聚焦手段建立蛋氨酸对奶牛乳腺上皮细胞影响的模型,经验证蛋氨酸可以使β-酪蛋白、STAT5等泌乳正相关信号分子表达能力增强(P<0.05),并使乳腺上皮细胞脂滴分泌明显增多。经生物信息学分析及以前的研究,在质谱结果得到的658个磷酸化蛋白中按涉及的功能不同选出20种泌乳相关的蛋白,检测它们在添加蛋氨酸的情况下mRNA表达量的差异,结果显示蛋氨酸处理组RP45、PK4、BAP18、CanX、 TFIP11、ETIF3F、eEF1B的mRNA表达上调差异极其显著(P<0.01), DDX27、EIF4G2、TRIP12、 Septin2和S6K1的mRNA表达上调差异显著(P<0.05),SF3A1、BAP1、PRP4, G3BP1和HSPB1的mRNA表达下调差异极显著(P<0.01)；EGFR1蛋白mRNA表达无显著差异(P>0.05)；Meta、LDLRAP1蛋白mRNA表达下调差异显著(P<0.05)。进一步用Western bloting方法再次验证eEF1B及S6K1的蛋白表达量,发现蛋氨酸组明显高于对照组(P<0.05)。结果提示RRP45、PK4、BAP18、CanX、TFIP11、ETIF3F、eEFIB、DDX27、EIF4G2、TRIP12、 Septin2和S6K1可能参与泌乳的正向调控,BAP1、PRP4、G3BP1、HSPB1、SF3A1、MTDH和LDLRAP1可能参与泌乳的负向调控以上实验结果为奶牛营养蛋白质组学的研究提供了理论依据和技术方法。