论文部分内容阅读
葫芦科作物是我国重要的水果和蔬菜,新品种的培育需要挖掘重要农艺性状的基因。黄瓜、西瓜和甜瓜等多种葫芦科作物基因组已被测序,这为优异基因的挖掘及其功能研究奠定了基础。葫芦科作物的遗传转化耗时费力且转化效率极低,病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术为葫芦科作物功能基因组学的研究提供了便利。本研究选择在自然条件下可侵染葫芦科作物的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)为材料,采用该病毒的侵染性克隆,首先摸索外源基因片段插入的位点、其次鉴定外壳蛋白(Coat Protein,CP)亚基因组启动子(Subgenomic Promoter,SGP),再分析沉默效应,从而构建了可用于研究葫芦科植物基因功能的VIGS载体。本文主要的研究结果如下:(1)明确了插入位点在CGMMV CP基因终止密码子与3’非编码区之间,不适合用于构建VIGS载体。在CGMMV侵染性克隆pXT1-CGMMV的基础上,通过点突变和同源重组的技术采取分段扩增的方式获得含单酶切位点HindIII的病毒载体1a23,经接种寄主植物表现的症状及结合DAS-ELISA和RT-PCR等检测证明该载体具侵染性。在此基础上构建了插入不同长度的八氢番茄红素脱氢酶基因(Phytoene desaturase,PDS)片段(114 bp、213 bp和300 bp)的VIGS载体,明确了该载体可承载的目标基因的长度为114 bp,但载体本身病毒症状太强覆盖了沉默表型。(2)鉴定了CGMMV CP的亚基因组启动子SGP。通过点突变和同源重组的方法对pXT1-CGMMV进行突变,构建了7个MP部分缺失的突变体和10个CP部分缺失的瞬时表达绿色荧光蛋白(Enhancedgreen fluorescent protein,EGFP)的载体,经Northern Blot和qRT-PCR对CP亚基因组RNA的积累量和EGFP的相对表达量的检测确定CGMMV CP的SGP活性区域,并结合生物信息学手段进行进一步验证。(3)构建了包含重复190 bp的CGMMV CP亚基因组启动子和一个单限制性酶切位点Bam HI的VIGS载体:CGMMV-BamHI。基于CGMMV CP亚基因组启动子鉴定的信息,确定了构建CGMMV VIGS载体的合适的插入位点,并证实了插入片段在100 bp~300 bp均可诱导葫芦科作物相关基因(PDS)的沉默,插入片段为69 bp的发夹结构时,接种植物出现光漂白表型时间较早,沉默效率介于插入片段为150 bp与213 bp的载体之间。本文明确了采用CGMMV病毒构建VIGS载体时外源基因片段的插入位点,鉴定了CGMMV亚基因组启动子,成功构建了基于VIGS载体,该载体具有引发症状轻微、沉默效率高等特点,为研究葫芦科作物基因功能提供了平台技术,必将有力促进葫芦科作物相关优异基因的挖掘与鉴定。