糖,又称为碳水化合物,是自然界分布最多的一类有机化合物;糖及糖缀合物在自然界所有生命体的活动过程中发挥了不可或缺的作用。糖核苷酸是Leloir型糖基转移酶催化复杂寡糖及糖缀合物生物合成所必需的供体底物,在化学结构上是由单糖和核苷单磷酸或二磷酸组成,是单糖的活化形式。糖核苷酸参与了生物体内正常生命活动和疾病发生发展等过程。目前已经发展了一系列化学、酶法及化学酶法等合成新策略用于糖核苷酸及其衍生物的制备,但是低收率、繁琐的过程和化学试剂的大量使用限制了这些方法的广泛应用。商业化的糖核苷酸的价格昂贵,严重阻碍了糖基转移酶合成复杂寡糖和糖缀合物以及糖生物学功能研究的发展。近年来,随着生物合成途径及基因组学研究的不断深入,模拟生物体内合成过程,在体外反应体系中酶法合成糖核苷酸类化合物已经成为可能。从最初的de novo途径到后来salvage途径,糖核苷酸生物合成途径的阐明促使以价格低廉的单糖为原料多酶级联合成糖核苷酸类化合物成为可能。但目前糖核苷酸的酶法合成还存在底物浓度低、纯化过程繁琐、耗时长等缺点,匮乏一种切实可行的糖核苷酸类化合物的大量制备新策略。为了解决制约复杂寡糖酶法合成的卡脖子问题,推动酶促反应体系在寡糖及糖缀合物合成方面的应用,论文第二章介绍了一种糖核苷酸类化合物经济高效制备新策略。通过优化酶促合成体系的底物浓度及反应组分,建立了糖核苷酸的高浓度多酶级联合成体系,时空产率较常用的5 mM反应体系提高了 40倍左右;通过分析反应组分的理化性质,发展了一种不依赖柱层析的选择性离子沉淀纯化新方法,实现了糖核苷酸产物的高效纯化。偶联高浓度多酶级联酶促合成和非柱层析依赖的选择性离子沉淀后处理操作,发展了一种糖核苷酸及其衍生物高效制备新策略。该策略表现出较好的通用性,能够在克级水平实现12种糖核苷酸及其衍生物的高效合成;利用起始单糖浓度为200 mM的20 mL缩合反应体系,能够以98%的纯度,1.6～2.3 g收率获得系列糖核苷酸产物。整个操作可以在一周内完成,极大提高了糖核苷酸的制备效率,彻底解决了制约糖基转移酶在复杂寡糖合成方面的瓶颈问题。为了进一步表征糖核苷酸类化合物的纯度和生物利用度,随后开展了肿瘤相关糖抗原Globo H及其衍生物的逐步酶法合成研究;与糖核苷酸再生系统相比,利用纯化的糖核苷酸进行复杂寡糖合成能够有效提高催化反应得率并简化产物纯化过程。上述糖核苷酸类化合物制备新策略,实现了糖核苷酸类化合物的经济高效制备,能够积极推动以糖核苷酸为底物的糖基转移酶在糖科学研究领域的应用和发展。糖胺聚糖（Glycosaminoglycans,GAGs）是一类以二糖重复单元构成、具有不同程度的硫酸化/异构化等修饰的线性杂多糖。GAGs广泛存在于哺乳动物细胞的表面,在维持细胞和组织的结构完整性方面发挥着重要作用。蛋白聚糖（Proteoglycan,PGs）生物学功能的发挥也依赖于共价连接的GAGs糖链。透明质酸（Hyaluronan,HA）是一种以游离形式存在、非硫酸化的GAG,是自然界中结构最为简单的一类线性多糖。HA因其出色的保水、润滑、粘弹和组织相容性等理化性质,被广泛地应用于眼科手术、术后黏连预防、烫伤治疗、关节炎治疗、美容及化妆品等方面;基于HA糖链的羧基和乙酰氨基等功能基团,进行化学交联制备的HA水凝胶也被应用于药物缓释及组织工程等领域。HA与肿瘤发生发展关系密切,肿瘤细胞中通常存在较高浓度的低分子量HA,能够促新生血管发生和炎症反应,是肿瘤预后的重要指标之一。商品化的HA生产方法主要有两种,动物组织提取法和微生物发酵法。这两种方法存在着交叉污染、毒素残留、糖链长度不易控制等问题。随着分子生物学技术的发展,体外酶法合成HA逐渐成为一种安全有效的替代方法。论文的第三章利用顺序一锅多酶（one-potmultienzyme,OPME）体系发展了 HA体外合成新策略。该策略偶联了单糖的活化和HA糖链聚合两个顺序反应过程,建立了一锅多酶级联催化反应体系:以价格低廉的单糖为原料,酶促转化为糖核苷酸;随后合成中间产物糖核苷酸无需纯化,直接用于透明质酸合酶（PmHAS）催化HA糖链的聚合。HA由二糖重复单元构成的结构特征决定了酶促合成过程中需要消耗等量的糖核苷酸;为了提高体外合成效率,通过优化合成体系组分比例,实现UDP-GlcNAc和UDP-GlcA以相同转化率进行合成。这种HA体外合成新策略能够避免糖核苷酸的直接使用,为HA的大量制备规提供了经济高效新方法,综合收率达70%以上。进一步利用原核来源生物酶底物宽泛性的优势,将单糖衍生物应用到一锅多酶反应体系中,合成了部分标记的HA衍生物。利用azido-alkyne特异性click反应,进一步制备了糖链内部交联、糖链间交联的HA 水凝胶。扫描电镜观察发现交联后的HA表面呈疏松多孔,与表面光滑且呈现均匀的片状结构的天然HA聚合物呈现出截然不同的表面形态。HA水凝胶的制备,为药物缓释和3D细胞培养等提供了材料,拓展了 HA的应用领域。尽管HA化学结构简单,但其分子量分布宽泛;在肿瘤微环境中,不同长度的HA介导了截然不同的生物学功能。高分子量的HA具有抑制抗血管生成和抗炎特性,而低分子量的HA尤其是HA寡糖,似乎是促进增殖和炎症的内源性“危险信号”。高效获得结构明确的均一 HA寡糖及多糖,是系统阐释HA糖链长度与其生物学功能的关系、理解HA糖链蕴含的生物学信息的前提条件。多杀巴斯德氏菌来源的PmHAS是目前已知的唯一一种Ⅱ型透明质酸合酶。PmHAS是一个双功能酶,具有 GlcNAc transferase（GN-T）和 GlcA transfease（GA-T）两个催化结构域。通过定点突变拆分PmHAS的双功能催化活性,获得两个具有单一催化活性的突变酶。课题组前期工作证明PmHAS催化糖链聚合过程中存在限速步骤,外源HA三糖是合成均一 HA的所必需的最小寡糖片段。利用PmHAS的催化特性,论文的第四章和第五章围绕结构明确的HA寡糖的体外酶法合成这一科学问题,开展了化学酶法合成方法学研究,制备了系列化学结构明确的HA寡糖、HA杂合寡糖及HA衍生物,开展了生物活性评价方面的研究工作。论文第四章发展了 HA寡糖片段的化学酶法重构合成策略。该策略以商品化HA多糖的水解产物HA四糖为糖链合成起始供体底物,交替使用GN-T与GA-T两个单一催化活性合成酶,建立了“一个循环-一个双糖单元”的HA寡糖片段合成新策略。利用HA糖链由二糖重复单元构成的结构特征,将合成路线分为奇数寡糖和偶数寡糖合成同步进行,实现了HA寡糖的高效合成和制备。进一步利用化学酶法制备了系列化学结构明确的HA寡糖片段衍生物。利用biotin-avidin、azido-alkyne等生物正交反应开展HA糖链的衍生化修饰,引入光敏和荧光基团,合成了一系列化学结构明确的光敏荧光HA探针;以人非小细胞肺癌细胞A549为模式细胞,开展了 HA寡糖片段的代谢检测,分析了 HA糖链长度对外源糖链代谢的影响,发现HA寡、多糖光敏探针均能进入细胞且由HA十二糖制备的荧光探针内化效率最高。这为HA荧光探针用于选择性靶向、多分析物检测与成像及奠定了基础。制备的HA光敏探针可进一步作为“诱饵”,与pull-down实验结合,利用糖蛋白组学技术,为发掘HA结合蛋白及受体提供了可能。硫酸软骨素（Chondroitin sulfate,CS）是哺乳动物体内最为丰富的糖胺聚糖之一,未硫酸化的软骨素（Chondroitin,CH）的糖链结构与HA具有高度相似性。硫酸软骨素蛋白多糖的CS侧链参与ECM内的各种相互作用,在恶性肿瘤中具有重要的生物学意义。CH也是一些致病菌荚膜多糖的组成成分。来源于多杀巴斯德氏菌的软骨素合成酶（PmCS）与PmHAS属于一类双功能酶,在核苷酸和氨基酸水平上90%相似,均有两个独立的催化位点。研究发现重组PmHAS和PmCS都能识别HA四糖和CS三糖等较小的寡糖片段作为糖链延伸的受体底物,但催化反应效率存在一定差异性。论文第五章建立了 HA-CH嵌合寡糖片段的模块化酶法合成策略。基于HA和CH化学结构的相似性,探究了 PmHAS、GN-T、GA-T以及PmCS的底物适应性。研究发现PmCS较GN-T、PmHAS对UDP-GalNAc的识别能力更佳,催化GalNAc至HA糖链底物的效果更好,而PmCS、GA-T、PmHAS具有相同的催化转GlcA单糖活性。可通过PmCS/GN-T和GA-T的交替添加,实现HA-CH嵌合寡糖的模块化合成。每个二糖重复单元内无需纯化过程,提高了 HA-CH嵌合寡糖的合成效率,实现了系列结构明确的6-16糖范围内HA-CH嵌合型GAGs寡糖片段的合成和制备。化学结构明确HA-CH嵌合寡糖片段的合成制备能够推动HA糖链构效关系研究,为回答HA糖链所蕴含的生物学信息、阐释糖链微观结构变化与其生物学功能的关系奠定基础。