论文部分内容阅读
目的：第一部分：构建人结缔组织生长因子(CTGF)基因真核表达载体，并在哺乳类Cos7细胞中获得表达，其表达产物具有促进脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖的生物活性。从而为进一步研究CTGF基因在血管新生和肿瘤中的作用奠定基础。第二部分：(1)探讨TGFβ1、内源性CTGF、外源性CTGF对胰腺癌细胞Panc-1增殖、凋亡以及细胞周期的影响。(2)研究CTGF在胰腺癌细胞Panc-1中的表达情况以及TGFβ1对CTGF基因表达的影响。(3)探讨CTGF单克隆抗体对TGFβ1促凋亡的抑制作用。(4)研究CTGF促进胰腺癌细胞Panc-1凋亡的作用机制，探讨CTGF的表达与胰腺癌细胞增殖和凋亡的关系。第三部分：(1)CTGF对HUVECs增殖的影响；(2)探讨CTGF对HUVECs细胞磷脂酰肌醇3激酶／蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase，PI-3K／PKB)信号传导通路的激活作用以及PI-3K抑制剂(LY294002)对其影响；(3)研究CTGF对HUVECs细胞细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信号通路的影响以及p-ERK抑制剂(U0126)对其影响。 方法：第一部分：根据人CTGF基因的cDNA序列，设计合成一对5’端分别含有XbaⅠ和HindⅢ酶切位点的特异性引物，运用RT-PCR方法扩增HUVECs中CTGF，回收PCR产物，并将其连接至克隆载体PMD-18T中。重组的PMD-18T在大肠杆菌DH5α内扩增后，经质粒提取、XbaⅠ和HindⅢ酶切，筛选出阳性重组子，并测序鉴定基因。琼脂糖凝胶电泳回收含有CTGFcDNA全长的酶切片段，然后在DNA连接酶作用下将其与真核表达载体pcDNA3.1(-)连接。重组质粒经XbaⅠ和HindⅢ酶切予以鉴定。并将其转染到Cos7细胞中，用Western blotting法证实其表达。以MTT检测转染上清对HUVECs的增殖影响。 第二部分：脂质体介导CTGF真核表达载体pcDNA3.1瞬时转染胰腺癌细胞系Panc-1。MTT法检测胰腺癌细胞的增殖情况。流式细胞仪检测胰腺癌细胞系Panc-1