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目的:研究血小板活化因子(platelet-activating factor,PAF)对培养的大鼠肺微血管内皮细胞(rat pulmonary microvascular endothelial cells,RPMVEC)中Src抑制的蛋白激酶C底物(Src-suppressed C kinase substrate,SSeCKS)mRNA表达的影响,观察信号通路抑制剂对炎症介导SSeCKS mRNA表达的干预作用,结合我们既往的工作进一步探讨PAF参与急性肺损伤(acute lung injury,ALI)发生的机制,并初步开展SSeCKS在炎症诱导RPMVEC损伤过程中基因表达的信号转导途径研究。方法:体外分离培养RPMVEC;建立RPMVEC中SSeCKS mRNA表达的原位杂交检测方法;根据PAF刺激时间和浓度的差异将RPMVEC随机分为PAF量效组和时效组:量效组分别以10-10、10-9、10-8、10-7 mol/L PAF与RPMVEC作用1.5 h,时效组以10-7 mol/L PAF与RPMVEC分别作用0.5、1.5、3、6、12、24 h;信号通路抑制剂干预:RPMVEC与10μmol/L核转录因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)抑制剂吡咯烷二巯基氨甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)预孵育1 h或10μmol/L蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)抑制剂双吲哚基顺丁烯二酰亚胺(bis-indolylmaleimide,BIM)预孵育0.5 h,再与10-7 mol/L PAF或10 mg/L脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作用1.5 h,以上均设正常、阴性和阳性对照组;原位杂交技术(in situ hybridization,ISH)与计算机图像分析系统软件结合运用检测不同条件下RPMVEC中SSeCKS mRNA的表达变化。结果: 1.体外成功进行RPMVEC的分离培养,并经形态学及FITC-BSI结合实验证实。2.成功建立经地高辛标记的寡核苷酸探针原位杂交检测RPMVEC中SSeCKS mRNA的实验方法。3.正常RPMVEC有SSeCKS mRNA少量表达,为棕黄色细颗粒状杂交信号,分布于胞质。10-10、10-9、10-8、10-7 mol/L PAF分别孵育RPMVEC 1.5 h,SSeCKS mRNA表达量随其浓度增加而逐渐升高,与正常对照组比较差异均有统计学意义。10-7 mol/L PAF刺激RPMVEC 0.5 h,SSeCKS mRNA表达水平即显著升高,1.5 h达峰值,之后逐渐下降,至24 h仍高于正常对照组。4. PDTC可显著下调PAF或LPS对RPMVEC中SSeCKS mRNA的诱导效应,而BIM对此效应无干预作用。结论: 1.成功进行RPMVEC的体外原代培养及鉴定。2.通过ISH与计算机图像分析系统软件的结合运用,成功检测不同条件下RPMVEC中SSeCKS基因的表达变化。3. PAF呈浓度和时间依赖的方式上调RPMVEC中SSeCKS基因的转录水平。4. NF-κB信号通路而非PKC参与了PAF、LPS诱导SSeCKS基因表达的信号转导机制。