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泛素-蛋白酶体途径被认为是在哺乳动物细胞中选择性的降解短寿命蛋白的主要系统。受调节蛋白主要与细胞周期进程、应激反应、抗原呈递、信号传导、转录调控、DNA损伤修复、凋亡、细胞器官的生物发生有关。泛素化是一系列酶级联传递泛素的结果。具体过程为,泛素激活酶E1催化泛素与底物蛋白结合,即以ATP依赖的方式通过硫醇酯键将泛素的C-端硫醇基与自身的半胱氨酸结合,然后将活化的泛素传递给泛素结合酶E2;泛素连接酶E3将结合着泛素的泛素结合酶和底物蛋白连接,从而促进泛素的羧基末端的甘氨酸与底物蛋白内部的赖氨酸ε的氨基之间形成异肽键,泛素与蛋白结合;部分底物蛋白尚需要多聚泛素化聚集因子E4参与多聚泛素链的形成。之后,泛素多聚链的蛋白分子被26S蛋白酶复合体识别和降解,泛素-C-末端水解酶或者异肽酶酶解释放泛素分子。
UbcH8是人的泛素结合酶基因UBE2L6编码的蛋白,属于主要包含Ubc结构域的第一类泛素结合酶家族(ClassIE2s)成员。第一类泛素结合酶家族分子不能将泛素分子直接传递给底物蛋白,提示这类E2需要借助泛素连接酶E3进行底物蛋白的识别。研究表明:UbcH8可以与RINGfinger或者BRmotif-containingdomain(inbetweenRINGfingers)以及HECT[6]等结构域的蛋白发生相互4作用。该酶已被证明可以在E6/E6AP促进p53的泛素化中起作用。另外UbcH8作为泛素连接酶还可以促进一种泛素样分子ISG15的传递。
核基质蛋白MINT(Msx2-interactingnucleartargetprotein)是1999年Newberry等在研究与同源盒转录抑制因子Msx2相互作用的蛋白时,发现的一个与Msx2共同参与颅面骨与神经的发育的新的脚手架蛋白。与此同时,日本京都大学的T.Honjo研究组在利用酵母双杂交系统筛选可以与RBP-J相互作用的新蛋白时,也筛选到了MINT分子(未报道)。MINT的转录物广泛分布于各个组织。近年来的对MINT功能上的研究主要集中于:神经发育、软骨和成骨,淋巴系统发育上。
MINT属于Spen蛋白家族。SPEN蛋白家族成员具有的共同特点是:含有多个RNA识别基序(RNArecognitionmotif,RRM)和一个保守的C-端的SPOC结构域[。SPOC结构域可以募集共抑制复合物SMRT/N-CoR从而发挥转录抑制作用。MINT可在许多不同的信号途径中调节关键的转录效应分子表达。Kuroda等和Oswald等发现MINT与Notch信号途径的关键性转录因子RBP-J相互作用,并可能通过与Notch受体胞浆区竞争结合RBP-J结合位点从而抑制Notch信号途径。Towler等研究认为:MINT具有增强Runx2募集于成纤维生长因子反应元件(OCFRE)的活性。最近我们研究组的研究表明:MINT也可以参与αA-晶状体球蛋白结合蛋白1介导的Col2a1基因的转录抑制。
MINT在人类中的同源物SHARP是以HDAC共抑制复合物的新组份的形式发现的。进一步的研究发现,HDAC的抑制剂TSA可以抑制MINT/SHARP所介导的转录抑制作用,这些说明MINT/SHARP的转录抑制作用是HDAC依赖性的。Towler等研究表明MINT可以作为作为核基质的平台组织和整合骨钙素基因5的转录反应;最近,FranzOswald等研究SHARP/MINT的转录机制时发现:一个包括CtIP/CtBP的抑制复合体可以促进RBP-J/SHARP-介导的Notch靶基因的转录抑制。总之,MINT可以通过蛋白-蛋白相互作用,募集HDAC或者CtIP和CtBP等方式调节许多包括Msx2,RBP-J,核受体,AlphaA-CRYBP1等转录因子介导的转录;另外在核基质中,MINT可以作为脚手架蛋白的平台组织和整合多个调控信号。MINT作为位于细胞核内的大分子脚手架蛋白,广泛分布于各个组织,其功能是复杂的,转录调控的机制也是多样的。对这两方面的研究还存在许多空白点。
为了进一步深刻理解MINT的功能和介导转录调控的机制,我们首先使用了酵母双杂交的方法,对MINT蛋白进行了相关蛋白的筛选。其中在对其C末端区域的筛选中,使用人的淋巴结的cDNA文库我们筛选到了一个编码人泛素结合酶UbcH8的UBE2L6基因。进而使用不同的MINT的截短体,利用酵母双杂交的方法再次对MINT与UbcH8相互作用的区域进行了初步定位。结果发现MINT的SPOC结构域介导它与UbcH8之间的相互作用,该区域已经被认为是介导MINT与其他分子相互作用的界面。之后,我们又使用了一系列的生物化学的方法(GSTpull-downassay、哺乳动物细胞内双杂交及免疫共沉淀实验)对MINT与UbcH8之间的体外和体内相互作用进行了深入验证,确证它们之间存在物理上的相互作用。最后;利用报告基因实验证实MINT与UbcH8之间相互作用的生理意义。结果显示:MINT抑制RBP-J介导的转录对于泛素-蛋白酶体途径的抑制剂MG132是敏感的。低剂量的MINT可以抑制Notch受体胞内段(Notchintracellulardomain,NICD)激活Notch信号途径的关键转录因子RBP-J调控的报告基因的活性,并且UbcH8可以增强MINT发挥转录抑制。因此我们初步得出结论:MINT介导的转录调控可以至少部分依赖于UbcH86所在的泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitinproteasomesystem,UPS)的调节。
此外,在确定UPS调节MINT调控的底物蛋白时,我们使用不同于NICD的激活物:EBNA2和VP16激活的RBP-J调节的报告基因系统。结果发现:加入UbcH8后,并不能增强MINT抑制EBNA2和VP16激活的RBP-J介导的转录活性,所以排除了RBP-J是UbcH8和MINT介导的泛素化底物。新的底物蛋白的筛选是先理论假设某底物蛋白可以被UPS泛素化后而被降解,并且该底物蛋白与MINT和UbcH8关联。在MINT相关的Notch信号途径中,NICD分子可以被泛素化,并可通过UPS降解[20]。那么MINT能否与NICD相互作用,并将泛素分子传递给NICD?我们首先使用酵母双杂交来验证上述假设的理论。通过酵母双杂交,我们初步得出:MINT的-N末端可以与NICD相互作用,符合了理论假设的前提条件。然而MINT是否在与UbcH8的相互作用中扮演泛素连接酶的作用向底物传递泛素分子?或者两者之间的相互作用可以介导MINT的泛素化修饰,或者MINT是以E2/E3泛素化复合体的形式扮演脚手架的结构平台作用?其底物蛋白是什么?NICD?与MINT相关的已经被证明可以被泛素化的Runx2?亦或是其他蛋白呢?这些问题仍需要进一步的深入研究。总之,本文提供的结果可能提示一种新的MINT介导的调控机制,这种新的调控机制有助于全面理解MINT蛋白的功能。