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研究背景鼻咽癌(NPC)是我国高发的头颈部恶性肿瘤之一,主要发病于我国的南方地区。但是由于其解剖位置较深和早期症状不典型,约80%的鼻咽癌患者在第一次就诊时就已经发展到晚期。放疗联合以铂类为基础的化疗为局部晚期鼻咽癌的标准治疗方法,虽然局部和区域控制率有所改善,超过30%的患者仍然发生复发和远处转移。面临这些挑战,迫切需要发展新的治疗策略,以提高局部晚期鼻咽癌患者的生存率。最新研究结果表明,鼻咽癌的发生、发展、转移与原癌基因编码的产物c-Met密切相关。c-Met蛋白属于肝细胞生长因子受体家族,c-Met通过与配体肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)结合,激活HGF/c-Met信号通路,降低细胞间的粘附力,有利于肿瘤细胞的转移。因此,c-Met可以成为鼻咽癌靶向治疗的潜在靶点。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞是一种将抗体靶向治疗和T细胞免疫治疗相结合的治疗方法。通过识别肿瘤表面抗原,带领T细胞到达肿瘤周围,发挥T细胞的免疫功能,实现识别并杀伤肿瘤细胞的能力。是一种很有发展空间的治疗肿瘤的策略。本研究拟在实验室已经制备好的抗c-Met Fab抗体的基础上,利用基因工程技术构建靶向c-Met CAR逆转录病毒载体,转染T淋巴细胞,制备c-Met CAR-T,观察其对鼻咽癌细胞生物学特性的影响,为鼻咽癌治疗提供新发法、新思路。研究目的1.构建靶向c-Met的嵌合抗原受体逆转录病毒载体。2.制备抗c-Met CAR-T;观察c-Met CAR-T对于c-Met阳性鼻咽癌细胞的增殖抑制作用;检测c-Met CAR-T与c-Met阳性的鼻咽癌共培养后细胞因子IFN-γ、IL-2 的变化。研究方法1.利用基因工程技术构建抗c-Met scFv,并将其重组到含有人IgG分子的CH2CH3以及CD28,CD137,CD3ζ等的逆转录病毒载体中,形成c-Met CAR逆转录病毒载体,经过测序检测确认。2.c-Met CAR逆转录病毒载体的感染293T细胞,通过Western blotting检测c-Met CAR在293T细胞中的表达。3.c-Met CAR逆转录病毒的包装后感染T淋巴细胞,通过Western blotting检测c-Met CAR在T淋巴细胞中的表达。4.通过流式、RT-PCR、Western Blotting方法筛选出表达c-Met的鼻咽癌细胞株,以及不表达c-Met的肿瘤细胞株。5.通过CCK-8法检测c-Met CAR-T细胞和对照组CD19 CAR-T、未转染T细胞与鼻咽癌细胞株CNE2、HONE1共培养4h、12h、24h后,对鼻咽癌细胞株的增殖抑制作用。6.c-Met CAR-T与鼻咽癌细胞共培养24h后,通过ELISA法检测细胞因子IFN-γ、IL-2 的变化。研究结果1.经PCR扩增、优化、酶切,连接等方法构建c-Met CAR逆病毒载体,经测序检测序列正确。2.c-Met CAR逆转录病毒载体感染293T细胞,裂解蛋白,Western Blotting检测到抗人CD3ζ抗体的表达,与预期大小一致。结果说明所构建的重组质粒能够在293T细胞中表达,293T细胞能够用于病毒包装。3.c-Met CAR逆转录病毒感染T淋巴细胞,裂解蛋白,Western Blotting检测到抗人内源性、外源性人CD3ζ抗体的表达分别为22KD、76KD,与预期大小一致。结果说明所构建的重组质粒能够在T淋巴细胞中表达,成功制备 c-Met CAR-T。4.通过流式、RT-PCR、Western Blotting成功筛选出表达c-Met的鼻咽癌细胞株CNE2和HONE1,以及不表达c-Met的对照组卵巢癌细胞株HO8910。5.CCK-8结果显示c-Met CAR-T与鼻咽癌细胞分别共培养4h、12h、24h,4 h时杀伤率最高。随着T细胞与肿瘤细胞比例的增加,对于肿瘤细胞的抑制作用就越明显。当比例为20:1时,杀伤率最高,c-MetCAR-T细胞对鼻咽癌细胞株 CNE2、HONE1 的杀伤率分别为 60.33 ± 3.73%、61.33 ± 4.73%。而对于对照组CD19CAR-T组和未转染的T细胞组(UTD)对HONE1、CNE2的杀伤率仅仅分别为 27.67 ±0.94%、26.67± 0.47%,30.67 ±1.70%、28.13 ±0.50%。相比差别有统计学意义(P<0.05)。6.ELISA结果显示c-MetCAR-T与c-Met阳性的鼻咽癌细胞株共培养后分泌细胞因子IFN-γ、IL-2明显增加;而与卵巢癌细胞共培养后细胞因子IFN-γ、IL-2只有微量。两组相比差别有统计学意义(P<0.01)。结论1.本研究成功制备了靶向c-Met的嵌合抗原受体逆转录病毒载体。该嵌合抗原受体能在T细胞中表达,成功制备c-MetCAR-T。2.c-Met CAR-T有效抑制c-Met阳性鼻咽癌细胞增殖,增加IFN-γ、IL-2的分泌。