目的:脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)是由多种病因引起的眼底疾病,严重影响患者视力。传统治疗方法作用机制均为消除已存在的异常血管,并未改变导致CNV形成的病理基础,因此不能阻止其复发。在CNV的多种发病机制中,补体的作用机制逐渐引起人们的重视,眼部的炎症反应和免疫活化在CNV的发生和发展中起着重要作用。补体活化过程中产生的活性片段具有炎症介质作用,其存在可能诱导CNV的生成。有研究发现补体通过旁路途径激活,在眼后段导致了膜攻击复合物(membrance attack complex,MAC)在RPE和/或脉络膜的形成和沉积,随之诱导血管生长因子释放,导致膜渗透性的暂时改变,释放的血管生长因子促进脉络膜内皮细胞的异常增殖,导致了CNV的发生。因此,补体活化的旁路途径可能是激光诱导大鼠CNV生成的根本原因,而B因子(complement factor B,CFB)作为补体旁路途径的重要因子可以成为我们阻断的靶点。本文采用激光诱导大鼠CNV模型,观察CNV中CFB、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和碱性成纤维细胞因子(basic fibroblast growth factor,BFGF)的变化规律,采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,使用前期研究中成功构建的CFB-siRNA将CFB沉默,阻断补体旁路途径,观察CFB-siRNA对CFB及血管生长因子VEGF、BFGF的抑制作用,为CNV的治疗开辟新的思路。　　 方法:　　 1实验性脉络膜新生血管中CFB、VEGF和BFGF的表达　　 1.18-10周健康棕色挪威(Brown Norway,BN)大鼠25只,随机分为5组,每组5只。氪激光(波长647nm,光斑直径200μm,功率260mW,曝光时间O.05s)围绕视盘均匀光凝9-10个点,以见到有气泡产生提示Bruch膜被击穿为准建立大鼠CNV模型。　　 1.2分别于光凝后第3、7、14、21、28d进行荧光素眼底血管造影(fluoresceinfundus angiography,FFA),并计算各时间点CNV发生率。　　 1.3造影后处死大鼠,摘除眼球取眼后段组织制作石蜡切片。选取有明确血管化的激光斑处做切片,常规HE染色。　　 1.4随机选取光凝后第3、7、14、21、28d切片,进行CFB、VEGF和BFGF免疫组化染色,并测定其灰度值。确定CFB的表达高峰时间点,为下步注药时间选取标准。　　 1.5图像分析与统计学处理　　 采用SPSS16.0软件对所得数据各时间点灰度值进行分析,观察各因子表达规律。绘制不同时间点CFB表达线图,观察CFB表达高峰时间。　　 2 CFB-siRNA抑制BN大鼠脉络膜新生血管的实验研究　　 2.1 BN大鼠36只,随机分为3组,每组12只。空白对照组不做处理,实验对照组和实验治疗组均给予激光光凝建立大鼠CNV模型。实验治疗组在B因子表达高峰前日,尾静脉注射CFB-SiRNA50mg,隔天注射一次,共注射三次。观察时间为光凝后3、7、14、21、28d。　　 2.2各组大鼠分别于光凝后第3、7、14、21、28d进行FFA。　　 2.3造影后6h待其体内荧光素染料大部分被排出后,处死大鼠,摘除眼球取眼后段组织制作石蜡切片。选取有明确血管化的激光斑处做切片,常规HE染色。　　 2.4各组均进行CFB、VEGF和BFGF免疫组化染色,并测定其灰度值。　　 2.5图像分析与统计学处理　　 采用SPSS16.0软件对各组灰度值进行正态性和方差齐性检验,当符合方差齐性和正态性分布时,采用单因素方差分析,组间均数的比较用SNK-q检验。不符合正态性分布或方差不齐时,采用秩和检验,两样本均数的比较用t检验,方差不齐时用近似t检验。对光凝后CNV发生率进行x2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。　　 结果:　　 1实验性脉络膜新生血管中CFB、VEGF和BFGF的表达　　 1.1 CNV在FFA中表现为早期强荧光斑,晚期出现与视网膜血管无关的荧光素渗漏。CNV发生率随着时间变化逐渐增多,在光凝后21d达高峰,之后略有下降。　　 1.2光镜可见到CNV自脉络膜穿过破裂的Bruch膜突向视网膜下,同时伴有巨噬细胞浸润、RPE细胞迁移增生和纤维母细胞增多等。　　 1.3 CFB在光凝后3天达最高峰,随后表达减少,光凝后7天仍有少量表达,光凝后2-4周表达趋于稳定。　　 1.4 VEGF和BFGF在光凝后7-14d表达明显增多,在光凝后21d达高峰,之后略有下降。　　 2 CFB-SiRNA抑制BN大鼠脉络膜新生血管的研究　　 2.1实验治疗组与实验对照组FFA进行比较,在光凝后14d、21d、28d两组CNV发生率差别有统计学意义(P＜0.05)。　　 2.2免疫组化结果显示:三因子各组数据均符合方差齐性和正态性分布,故采用单因素方差分析,组间均数的比较用SNK-q检验。空白对照组正常大鼠CFB、VEGF和BFGF在视网膜和脉络膜中的表达非常弱。在光凝后7d、14d、21d、28d,实验治疗组与实验对照组CFB灰度值差异有统计学意义。光凝后14d、21d、28d,实验治疗组与实验对照组VEGF和BFGF灰度值差异有统计学意义,实验治疗组表达水平受到抑制。　　 结论:　　 1补体激活旁路途径在CNV生成中扮演重要角色,光凝诱导CNV中补体旁路途径的激活引起了CFB的活化,进而上调VEGF和BFGF的表达,CFB为VEGF和BFGF的上游调控因子。　　 2尾静脉注射CFB-SiRNA能够有效抑制激光诱导CNV的生成,其通过抑制CFB可减少CNV中VEGF和BFGF的表达。