尿路上皮癌(urothelial carcinoma UC)是最常见的泌尿系肿瘤，最新的流行病学报告显示UC分别占男性和女性恶性肿瘤发病的第五位和第十位。UC是一个多因素和多阶段的逐渐发展过程，涉及到抑癌基因的失活、癌基因的活化、细胞周期的调控失常、基因启动子的转录活化异常等遗传学或表遗传学异常等诸多方面。人类基因组有两类遗传信息，一类是提供生命必需的蛋白质模板信息，称遗传学的信息；而另一类称表遗传学的信息，是指在何时、何地、以何种方式应用上述蛋白质模板信息的指令信息。表遗传学信息状态的确定可为肿瘤的早期诊断及基因治疗提供依据。有研究结果表明，表遗传学改变多发生在肿瘤发生的早期，此时肿瘤细胞还未对人体造成实质性损害，如能在此时进行人工干预，即有可能将肿瘤扼杀在摇篮中。启动子甲基化和组蛋白乙酰化是表遗传学修饰最重要的二种机制。5-氮杂脱氧胞苷(5-aza-dC)是现今最重要的DNA甲基化转移酶(DNMT)抑制剂之一，而曲古抑菌素A(TSA)则是研究最多的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂，二者的联合使用可以促使肿瘤细胞的分化并诱导肿瘤的凋亡。已有研究表明维甲酸(RA)浓度过低参与了膀胱癌的发生，使用维甲酸在治疗膀胱癌中也取得一定进展。而ALDH1a2是催化视黄醛的氧化成维甲酸关键酶之一。有研究证明人类醛脱氢酶家族中ALDH1a2基因启动子区域高甲基化可导致前列腺癌发病率升高，但在膀胱癌细胞株中仍无相关研究。我们首先对5株膀胱癌细胞株及11例正常膀胱上皮组织的ALDH1a2启动子甲基化状态与mRNA，蛋白表达进行相关性研究后，再采用5-aza-dC、TSA处理膀胱癌细胞株逆转其甲基化状态后，探讨对其影响进而诱导膀胱癌细胞凋亡的机制。目的探讨ALDH1a2基因在膀胱癌细胞株的甲基化状态和表达及5-aza-dC、TSA对其影响进而诱导膀胱癌细胞凋亡的机制。方法1．5-aza-dC及TSA处理膀胱癌细胞。2．采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测五株膀胱癌细胞株(BIU-87，RT-4，253J，5637，T24)及正常膀胱上皮组织经5-aza-dC、TSA处理前后的ALDH1a2启动子甲基化。3．采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析正常膀胱上皮组织及五株膀胱癌细胞株经5-aza-dC、TSA处理前后ALDH1a2基因mRNA的表达。4．采用Western blot检测经5-aza-dC、TSA处理前后五株膀胱癌细胞株及正常膀胱上皮组织ALDH1a2基因蛋白的表达。5．采用AnnexinⅤ／PI双标记法，检测经5-aza-dC、TSA处理前后的五株膀胱癌细胞株的凋亡及坏死。结果1．在正常膀胱上皮组织中，ALDH1a2基因启动子区CpG岛表现为低甲基化。在五株膀胱癌细胞中，ALDH1a2基因启动子区CpG岛均表现为较高的甲基化；TSA不影响ALDH1a2基因DNA甲基化水平；应用5-Aza-dC能使ALDH1a2基因启动子区CpG岛发生去甲基化；联合给予5-Aza-dC及TSA的作用和单独给予5-Aza-dC相似。五株膀胱癌细胞中，RT-4、253J和5637细胞与BIU-87，T24细胞不尽相同，后者启动子区CpG岛甲基化程度更高并且更容易去甲基化。2．ALDH1a2基因在正常膀胱上皮组织有表达。在五株膀胱癌细胞中均无表达；经TSA作用后也无表达；5-Aza-dC作用后，RT-4、253J和5637细胞中有较弱表达：吸光度相对值为0．168，0．146，0．153，均来源于低分化高度恶性的BIU-87，T24细胞中有稍强表达：相对值为0．342，0．402；联合作用后五株细胞均有较强表达：相对值为0．293，0．324，0．421，0．658，0．753，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0．05)。3．ALDH1a2基因蛋白在正常膀胱上皮组织有表达。在五株膀胱癌细胞中均无表达；经TSA作用后，T24细胞中有少量表达，其他四株细胞无表达；5-Aza-dC作用后，五株细胞均有表达，在T24细胞中表达较强；联合作用后五株细胞中均有较强表达。4．TSA和5-aza-dC均可诱导膀胱癌细胞株凋亡，五株膀胱癌细胞早期凋亡与晚期凋亡及坏死的变化趋势稍有不同，前者呈直线上升趋势，早期凋亡是膀胱癌细胞株死亡的主要方式，晚期凋亡／坏死的细胞相对较弱。三个实验组的细胞凋亡率分别与对照组比较，差异均有统计学意义(P＜0．05)。在实验浓度下，TSA组和5-aza-dC组诱导凋亡的效果以后者稍强。差异有统计学意义(P＜0．05)。使用5-aza-dC、TSA联合作用后，细胞凋亡明显增加，与TSA组和5-aza-dc组相比较差异有统计学意义(P＜0．05)。结论膀胱癌细胞系中抑癌基因ALDH1a2基因启动子甲基化可能是导致其基因功能失活的主要原因。5-Aza-dC单独作用和5-Aza-dC及TSA联合应用效果相似，均能逆转ALDH1a2基因甲基化，恢复基因表达，进而诱导膀胱癌细胞株的凋亡。第一部分ALDH1a2基因在膀胱癌细胞株和正常膀胱上皮的甲基化状态及其表达目的探讨ALDH1a2基因在五株膀胱癌细胞株和11例正常膀胱上皮的甲基化状态及其表达。方法1．体外培养RT-4，253J，5637，BIU-87，T24五株膀胱癌细胞株。2．甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测五株膀胱癌细胞以及11例正常膀胱上皮中ALDH1a2基因启动子甲基化水平。3．RT-PCR分析膀胱癌细胞以及正常膀胱上皮中ALDH1a2基因mRNA的表达。4．Western blot检测膀胱癌细胞以及正常膀胱上皮中ALDH1a2蛋白的表达。结果1．在正常膀胱上皮中，检测出未甲基化条带，ALDH1a2基因启动子区CpG岛呈低甲基化状态；五株膀胱癌细胞中，检测出甲基化条带，ALDH1a2基因启动子区CpG岛均表现为高甲基化状态。2．正常膀胱上皮中ALDH1a2基因mRNA有表达，而在RT-4，253J，5637，BIU-87，T24膀胱癌细胞株中均无表达。3．ALDH1a2基因蛋白在在正常膀胱上皮中有少量表达，而在BIU-87，RT-4，253J，5637，T24细胞中均无表达。结论正常膀胱上皮ALDH1a2基因启动子区CpG岛呈低甲基化状态，基因表达正常；五株膀胱癌细胞中，ALDH1a2基因处于高甲基化状态，表达受到抑制。第二部分5-aza-dc、TSA逆转膀胱癌细胞ALDH1a2基因甲基化状态与诱导膀胱癌细胞株凋亡的机制目的探讨5-aza-dC、TSA逆转膀胱癌细胞ALDH1a2基因甲基化状态与诱导膀胱癌细胞株凋亡的机制。方法1．5-aza-dC及TSA处理体外培养的RT-4，253J，5637，BIU-87，T24五株膀胱癌细胞。2．甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测5-aza-dC及TSA处理前后的五株膀胱癌细胞中ALDH1a2基因启动子甲基化水平。3．RT-PCR分析5-aza-dC及TSA处理前后的五株膀胱癌细胞ALDH1a2基因mRNA的表达。4．Western blot检测5-aza-dC及TSA处理前后的五株膀胱癌细胞以及正常膀胱上皮中ALDH1a2蛋白的表达。5．倒置显微镜镜观察5-aza-dC及TSA处理前后的五株膀胱癌细胞，采用AnnexinⅤ／PI双标记法标记细胞，AnnexinⅤ和PI的双重染色可将细胞分4类：活细胞(AnnexinⅤ、PI均为阴性染色)，早期凋亡细胞(AnnexinⅤ阳性，PI阴性)，机械损伤细胞(AnnexinⅤ阴性，PI阳性)和晚期凋亡及坏死的细胞(AnnexinⅤ、PI均为阳性)。流式细胞仪检测各种凋亡及坏死细胞的数量，并进行分析。结果1．在RT-4，253J，5637，BIU-87，T24五株膀胱癌细胞中，ALDH1a2基因启动子区CpG岛均表现高甲基化；TSA不影响ALDH1a2基因DNA甲基化水平；应用5-Aza-dC能使ALDH1a2基因启动子区CpG岛发生去甲基化，与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0．05)；联合给予5-Aza-dC、TSA的作用和单独给予5-Aza-dC相似，比较无统计学意义(P＞0．05)。2．五株膀胱癌细胞中均无ALDH1a2基因mRNA表达；经TSA作用后也无表达；5-Aza-dC作用后，RT-4、253J和5637细胞中有较弱表达，BIU-87，T24细胞中有稍强表达；经5-Aza-dC、TSA联合作用后五株细胞均有较强表达。3．ALDH1a2基因蛋白在五株膀胱癌细胞中均无表达。经TSA作用后，T24细胞中有少量表达，其他四株细胞无表达；5-Aza-dC作用后，五株细胞均有表达，在T24细胞中表达增强；5-Aza-dC、TSA联合作用后五株细胞中均有较强表达，与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0．05)。4．5-aza-dC、TSA均可诱导膀胱癌细胞凋亡。五株膀胱癌细胞早期凋亡与晚期凋亡及坏死的变化趋势稍有不同，前者呈直线上升趋势，早期凋亡是膀胱癌细胞株死亡的主要方式，晚期凋亡／坏死的细胞相对较弱。三组实验组的细胞凋亡率分别与对照组比较，差异均有统计学意义(P＜0．05)；TSA组和5-aza-dC组诱导凋亡的效果以后者稍强。相互比较有统计学意义(P＜0．05)；5-aza-dC+TSA组，细胞凋亡明显增加，与TSA组和5-aza-dC组相比较差异有显著性意义(P＜0．01)。结论膀胱癌细胞株ALDH1a2基因高甲基化是基因沉默的主要原因，5-aza-dC单独作用与5-aza-dC、TSA联合应用均可五株逆转膀胱癌细胞株ALDH1a2基因甲基化状态，恢复基因的表达，进而诱导膀胱癌细胞凋亡；TSA和5-aza-dC诱导膀胱癌细胞株凋亡的效果以后者稍强，5-aza-dC、TSA联合作用后，膀胱癌细胞凋亡明显增加。