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利福霉素SV由地中海拟无枝酸菌Amycolatoposis mediterranei产生,在生物合成过程中受芳香族氨基酸、利福霉素芳香前体C<,7>N的结构类似物及利福霉素SV的反馈调节。本文根据利福霉素SV生物合成途径和代谢调控理论,对利福霉素SV的产生菌进行了推理选育。原始出发菌种Amycolatoposis mediterranei 177经自然选育和原生质体融合分别得到Amycolatoposis mediterranei49和Amycolatoposis mediterranei 174,作为两株不同的诱变出发菌株。
选用不同的诱变剂对诱变出发菌株进行诱变处理,分别经过50μg/ml的吖啶黄诱变处理、1%硫酸二乙酯(DES)处理16min、15W的UV照射60s、0.1 mol/ml的HNO<,2>诱变处理5min、0.8mg/ml的亚硝基胍(NTG)处理40min、UV照射40s和0.1 mol/ml的HNo<,2>处理3min复合诱变以及UV照射40s和1%的DES处理10min复合诱变,再分别采用0.1%的L-色氨酸、0.5%L-色氨酸、0.1%邻氨基苯甲酸和0.05%的利福霉素SV进行药物耐受筛选,并结合自然选育进行分离纯化,经过琼脂块初筛以及摇瓶发酵复筛,最终获得利福霉素sv生产菌株Amycolatoposis mediterranei7-35,其摇瓶发酵单位达到6518μg/ml,较出发菌株Amycolatoposis mediterranei49提高了18.5%。
为了充分体现高产菌株Amycolatoposis mediterranei7-35的生产优势,激发其产利福霉素SV的潜力,进一步对其发酵培养基进行了调整和优化。选取鱼粉、豆饼粉和KNO<,3>三个因素进行单因素以及正交试验,确定其发酵培养基的最佳组合是鱼粉的添加量为0.5%、豆饼粉的添加量为1.2%和KNO<,3>的添加量为0.6%,此条件下利福霉素SV生产菌株Amycolatoposis mediterranei7-35摇瓶发酵单位达到6735μg/ml,其发酵产量较发酵培养基调整前提高了3.3%。
对利福霉素SV高产菌株Amycolatoposis mediterranei7-35连续5次传代,在同一条件下进行摇瓶发酵,分别测摇瓶发酵单位,其利福霉素SV发酵单位稳定在6300μg/ml以上,说明利福霉素SV生产菌株Amycolatoposis mediterranei7-35具有良好的传代遗传稳定性。