小麦作为世界上分布最广、种植面积最大、加工制品最为丰富的粮食作物之一,其农业地位的重要性不可忽视。然而随着水资源的日益匮乏及土地荒漠化的日趋严重,非生物胁迫如高盐、干旱等对小麦品质的提高及产量的增加形成了较大的负面影响。加之非生物胁迫应答是由多基因控制的复杂性状,涉及到细胞防御、离子平衡、次生代谢以及能量代谢等诸多方面。且小麦作为异源六倍体,同拟南芥等模式植物相比,耐盐机制研究的复杂性相应增加,生长周期也相对延长,因此,即便与水稻、玉米等其他作物相比,小麦逆境分子机理的研究仍然进展缓慢。由于小麦属于甜土植物,自身耐盐能力不强,而其野生近缘物种则是抗逆改良的重要基因库,可作为基因工程和细胞工程技术培育耐逆新品种的重要基因源。本实验利用不对称体细胞杂交渐渗技术,获得了盐敏感小麦品种济南177(Triticum aestivum2n=42, JN177)与强耐盐性小麦近缘属长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum,2n=70)的渐渗系抗盐新品种山融3号(SR3)。山融3号的耐盐指数及各项生理生化指标均明显优于亲本小麦JN177,其耐盐性由主效基因和微效基因共同控制。在本实验前期对SR3全基因组芯片和蛋白组分析的基础上,我们发现两个受胁迫表达变化的基因,结合SR3盐胁迫cDNA全长文库和RACE手段,获得基因全长。下面分别对两个基因进行功能验证,主要的研究内容及结果包括：1.小麦耐盐相关基因TaHB30的克隆及初步功能分析通过分析SR3盐胁迫cDNA全长文库基因,发现了一个受盐胁迫表达显著上调的基因,依据文库编号将其命名为TaHB30。在对其编码的蛋白序列进行Blast分析时,发现该基因含有Cu/Zn超氧化物歧化酶典型的激活位点,并包含有4个Cu2+结合位点和4个Zn2+结合位点,将其归类于Cu/Zn超氧化物歧化酶大类。200mM NaCl处理条件下,在SR3及其亲本JN177根叶中总体为上调的表达趋势；10mM过氧化氢处理后,根部的变化情况SR3同JN177较为一致,都呈现先下调后上调的波动变化。叶中SR3仍为先下调后上调的趋势,而JN177则是下调表达。在这些处理中,TaHB30在SR3中的表达量均高于JN177。由于Cu/Zn超氧化物歧化酶在植物细胞中分布比较广泛,为确定TaHB30的功能作用部位,对基因表达产物进行亚细胞定位。通过该蛋白偶联GFP,基因枪法转化洋葱表皮细胞和PEG诱导拟南芥原生质体,GFP荧光信号一致出现在细胞质与细胞核中,表明该基因产物主要在胞质同核中起作用。构建TaHB30表达载体并分别转化拟南芥和小麦,对拟南芥过表达转基因株系(OE系)在多种逆境胁迫下的表型进行分析。在对照条件下,OE系和对照株系生长状况正常,没有明显差异；在不同浓度的Mannitol处理下,OE系与对照株系差异也不明显。但当NaCl浓度增加到50mM以后,OE系的生长状态明显好于对照株系,主根根长同对照植株相比较长,侧根的生长也比对照株系发达。在添加H2O2的培养基上,OE系的生长状况也明显优于对照株系。随后进行了不同种类激素,包括IAA、JA、ABA与GA3的处理,在对照和转基因株系中都未发现表型的明显差异。初步推测,TaHB30通过增强ROS途径促进OE系的耐盐能力,同相关的植物激素信号通路没有交汇。利用拟南芥突变体验证该基因功能,将TaHB30转化拟南芥突变体,发现TaHB30过表达拟南芥突变体在正常条件下比对照系的根短,而在NaCl和H202的处理下这种根长度的差异消除,推测与该基因调控拟南芥内源ROS的信号途径有关。RT-PCR和real time PCR结果显示,正常生长条件下,拟南芥过表达株系(OEl,OE2)本底的超氧化物歧化酶(SOD)编码基因比对照株系表达量增高；而其下游多个ROS清除酶编码基因表达上调：谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)表达量的增幅最为显著,其他如过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)分别编码的2个基因在OE系的表达量同对照也具有显著差异。值得注意的是：位于ROS途径上游、与H2O2产生密切相关的NADPH氧化酶编码基因RBOH-D, RBOH-F的表达明显提高,并且在同时含有H202和NADPH氧化酶抑制剂的培养基上,OE系的生长状况不再优于对照株系；在正常条件下,TaHB30过表达拟南芥突变体的RBOH-D基因表达变化不显著,而GPX基因的表达量对照系比较明显上调。以上结果表明：小麦Cu/Zn超氧化物歧化酶基因TaHB30通过调控NADPH氧化酶的变化,进入ROS信号途径而在耐盐中起作用。进一步测定了OE系及空载体对照的ROS相关酶活性,结果表明：OE系的ROS清除酶系统中总超氧化物歧化酶(SOD)和Cu/Zn超氧化物歧化酶的酶活力都较对照提高；过氧化氢酶(CAT)的酶活力约为对照的1.5-2倍；谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的酶活力约为对照的1.3倍。而ROS的产生酶-非特异性NADPH氧化酶(NOX)活性也在过表达拟南芥中明显升高(1.6倍)；DAB染色显示,TaHB30过表达株系中H202含量明显低于对照植株；而NBT染色后,超氧阴离了的含量高于对照植株。以上结果表明：TaHB30通过调节ROS信号转导系统提高植物耐盐性。2.小麦耐盐相关基因TaCHP的功能分析通过本实验前期工作,发现了一个盐胁迫应答新基因TaCHP,编码一个CHP-rich(半胱氨酸,组氨酸和脯氨酸丰富)的锌指蛋白家族基因。TaCHP含有能特异性结合磷脂信号分子甘油二酯(DAG)的C1结构域和可能的激酶结构域,含有该结构域的蛋白质大多具有蛋白激酶(定位细胞膜)和/或转录调控因子(定位细胞核)活性。本研究发现,TaCHP定位在细胞膜和细胞核,推测是一个具有蛋白激酶和转录因子双重功能的抗逆相关重要蛋白。体外PKC激酶活性测定表明,TaCHP表达蛋白无激酶活性。转录激活活性分析发现C’端两个C1结构域及TaCHP全长具有转录激活活性,表明该基因可能作为一个转录因子行使功能。进行TaCHP胁迫表达模式及其定位分析,发现TaCHP主要在三叶期的小麦根部表达,原位杂交结果表明转录产物定位于根尖的皮层和分生组织细胞内。TaCHP表达量在SR3中比亲本JN177高,通过NaCl,干旱,ABA等处理后,二者都呈现下调趋势。但是,SR3总体表达量均维持在比JN177明显高的水平。将TaCHP转化盐敏感小麦济南17,小麦的耐盐、抗旱、抗氧化能力及相关生理生化指标都明显提高,证明了该基因的抗逆功能。构建了TaCHP过表达(BS、A5)拟南芥株系,进一步研究该基因可能的作用机制。除了耐盐性以外,拟南芥对H202和ABA的耐受性也有所增加。在盐处理下,过表达系中一部分胁迫响应基因(AtCBF3, AtDREB2A, AtABI2和AtABI1)的表达量升高,而ABA合成基因AtAA03, AtABA2和AtMYB15的表达量降低。Real-time PCR显示转基因拟南芥BS、A5的AtRBOHD表达量平均增幅达7倍,其编码的NADPH氧化酶是ROS产生的重要组成部分,而活性氧清除酶CAT和APX编码基因AtCAT2、AtAPX2在拟南芥过表达株系中被诱导,结合转基因拟南芥BS、A5株系中较高的SOD和CAT酶活性,表明ROS的产生及清除能力在过表达株系中都增强。以上结果表明：TaCHP通过ABA依赖和非依赖信号途径以及ROS信号途径参与植物对非生物胁迫的响应。