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副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）是猪的一种常见病原菌,可引起猪的格拉泽氏病（Gl?sser disease）,不同年龄阶段的猪均可感染,临床上血清型众多,不易控制,且常常与其他病毒混合感染。在临床治疗上,抗生素是该病防控的首选,而抗生素的滥用更加速了副猪嗜血杆菌耐药性的产生。天蚕素B（Cecropin B,CB）是从惜古比天蚕中发现的具有广谱抗菌活性的天然昆虫抗菌肽（Antimicrobial Peptide,AMP）,是一种潜在的治疗感染性疾病的候选药物,具有极大的研发价值。在前期的研究中,我们发现经CB诱导后,副猪嗜血杆菌可产生耐药性,并且与一些基因有关。基因HAPS2096编码产物为副猪嗜血杆菌ABC型氨基酸转运泵周质底物结合蛋白（Periplasmic substrate binding protein,PSBP）,ABC转运泵家族在细菌耐药机制中十分关键。本研究证实了HAPS2096在副猪嗜血杆菌对CB的抗性中起到重要作用,并且试图探索该基因介导耐药的相关机制。1.HAPS2096基因缺失株及缺失互补株的构建根据同源基因交叉互换的原理,构建具有与HAPS2096基因有相同同源臂的自杀载体p K-kan,自然转化HPS0135,获得具有卡那霉素抗性的HAPS2096基因缺失株。将含有HAPS2096启动子及其整个开放阅读框的基因片段克隆到经实验室改造过的内源载体p SHk3上,电转化到基因缺失株中,同时转化相应空载体作为对照株。经极性效应、PCR、RT-PCR及基因序列Blast验证上述各菌株构建成功。测定生长曲线发现各菌株生长无明显差异。2.各菌株对CB敏感性试验根据CB对HPS最小抑菌浓度（MIC）设置一系列CB反应浓度,细菌数量为105CFU/m L。基因缺失株和野生株与CB作用1h后,当CB终浓度为0.25μg/m L时,JS0135的存活率为12.02%,显著高于ΔHAPS2096的存活率5.16%（p<0.05）;同样,当CB终浓度为0.125μg/m L时,JS0135的存活率为26.62%,显著高于ΔHAPS2096的存活率13.09%（p<0.05）选择终浓度0.25μg/m L的CB,作用1h后,在该浓度下,含空载体对照株存活率为1.81%,显著低于互补株的存活率6.82%（p<0.05）。在琼脂扩散试验中,将1μg/m L的CB溶液加入琼脂孔中,37℃孵育20h后,基因缺失株出现较明显的抑菌圈,而野生株并未出现可见抑菌圈。3.免疫电镜对CB处理后基因缺失株及野生株形态观察各菌株与终浓度为0.5μg/m LCB孵育0.5h后,用纳米金标记的抗CB二抗与其作用后,免疫电镜可观察到完整的CB颗粒,野生株的细胞膜比基因缺失株光滑完整,且基因缺失株胞膜与胞质界限模糊,细胞破裂较多。在基因缺失株中,CB主要聚集在细菌胞膜上,而在野生株中,CB主要分布在细胞质中。4.Far Western-blot验证PSBP与CB互作将HAPS2096基因克隆到原核表达载体上,成功获得可溶性融合蛋白GST-PSBP。与CB孵育后,利用抗CB抗体对其进行检测,Far Western-blot显示,CB与GST-PSBP有结合作用,而与GST标签对照蛋白无结合作用。以上结果表明,ABC型氨基酸转运泵的周质底物结合蛋白在副猪嗜血杆菌对CB抗性中起到十分重要的作用,其作用机制是通过与CB结合,可能将其转运到胞质内,减少其对细菌胞膜的破坏,从而表现出对CB的抗性。