论文部分内容阅读
研究背景:PML核体（PML-NBs）是哺乳动物细胞核内存在的直径从0.1-1μm不等的无膜细胞器。作为一个细胞核内蛋白质富集的场所,已经报道了PML核体内存在超过200种成分蛋白,这些成分蛋白广泛参与了转录调控,细胞周期进程,蛋白质翻译后修饰（PTM）,DNA损伤修复,病毒侵染,凋亡,细胞应激等众多生命过程。其中,PML-NBs作为重要的PTM平台,一个重要的功能是提供SUMO化修饰环境。SUMO化是真核细胞中存在的一种类似于泛素化的翻译后修饰途径,在脊椎动物中,已经报道了SUMO家族中的5种成员:SUMO-1,同源性较高的SUMO-2/3,以及新发现的SUMO-4和SUMO-5。SUMO-2/3存在自SUMO化位点能够形成多聚SUMO链,而SUMO-1只存在单SUMO修饰。但区别于泛素化修饰,SUMO分子的结合往往不会造成靶蛋白降解,而是对其结构和功能产生影响,如结构激活,定位变化,保护蛋白免于泛素介导的降解等。人类蛋白质组中有约24%的蛋白质存在SUMO化修饰位点,而PML-NBs的成分蛋白中,这一比例高达48%。DAXX是一个典型的PML-NB成分蛋白,既能被SUMO化,也含有SIM基序;而且DAXX是组蛋白H3.3和异位CENP-A分子伴侣。CENP-A作为着丝粒的表观遗传标志,与其他着丝粒-动粒蛋白组成着丝粒相关网络（CCAN）,在维持染色体组稳定方面发挥重要作用。已经有报道指出部分CCAN蛋白被SUMO化修饰,而PML-NBs作为细胞中SUMO化的热点区域,其与着丝粒-动粒的关系却仍没有受到太多关注。先前有团队报道PML与Sp100（一个典型的PML结合蛋白）的共定位与细胞周期存在相关性,且PML-NBs进入分裂期后PML分子流动性降低,表明其与细胞周期进程存在一定的关系。研究方法:首先我们通过免疫荧光对不同细胞周期的He La细胞进行染色,发现与间期细胞相比,分裂期的细胞中PML-NBs的数量显著降低。我们进一步检测PML在蛋白水平的变化,发现不同细胞周期中的PML表达水平并未降低,推测PML-NBs数量减少是由于细胞中游离/聚集的PML动态平衡发生改变所导致的,即进入分裂期后,游离的PML增多而聚集在核体的PML数量减少。由于SUMO被认为是PML-NBs形成起重要作用的分子,因此,我们构建了Flag标签的PML,在He La细胞中过表达并进行细胞周期同步化,分别收集间期和分裂中期细胞,通过免疫沉淀及免疫印迹检测中期细胞SUMO化水平。为了研究PML-NBs对动粒定位蛋白（包括CCAN蛋白及有丝分裂相关激酶）定位的影响,我们利用CRISPRi对He La细胞的PML和DAXX分别进行敲降,并对这些着丝粒-动粒蛋白进行免疫荧光染色,以着丝粒标志蛋白CENP-B为参照,对荧光信号强度进行定量检测。我们还对PML-NBs的组装机制进行了进一步探究,通过构建截短载体,确定PML-NBs组装成核体的关键结构域,并以此为基础,通过引入拟南芥（Arabidopsis thaliana）CRY2基因中的光解酶同源区（PHR）结构域,构建光诱导的PML-NBs系统,进一步研究PML-NBs的动态变化对细胞周期等细胞生命活动的影响。研究结果:我们通过免疫印迹实验发现PML-NBs在细胞周期中的动态变化并不是PML蛋白的增减造成的,免疫沉淀的结果表明,PML的SUMO化修饰水平是决定不同时期PML-NBs数量的关键因素,后续免疫荧光的定量结果支持了这一结论。我们的CRISPRi敲降系统分别成功地降低了He La细胞中內源PML和DAXX表达,通过统计不同着丝粒-动粒蛋白在各自相应时期的定位及荧光强度,我们发现,绝大多数着丝粒-动粒蛋白的定位不受PML缺陷影响,仅有CENP-F和MAD2与对照组相比表现出十分微弱的差异;而CENP-A,CENP-C,CENP-F受DAXX敲降影响表现定位异常。通过构建coiled-coil（CC）结构域截短的PML载体,我们发现CC结构域缺失后PML无法聚集成PML-NBs。我们在PML-d CC蛋白上引入CRY2蛋白的PHR结构域,并在He La细胞中表达。虽然该系统还需改进,但我们发现,引入PHR结构域后,经过蓝光激活可以诱导形成PML核体样结构。研究结论:PML蛋白质水平在整个细胞周期中保持稳定,但PML的SUMO化修饰水平影响PML-NBs的动态平衡,导致分裂期细胞中PML-NBs数量减少。虽然PML-NBs作为细胞核中蛋白质修饰的重要场所,但PML敲降却几乎不影响CCAN蛋白及有丝分裂相关激酶定位在着丝粒/动粒区域定位。该结果符合预期,因为根据以前的研究报道,不管在细胞还是小鼠中对PML敲除都不会致死。DAXX敲降后部分着丝粒-动粒蛋白表现定位异常。而CENP-F是在本研究中唯一在PML和DAXX分别敲降后都表现出差异的着丝粒分子,其影响和分子机制仍有待我们进一步研究。目前已鉴定出100多种着丝粒-动粒蛋白,还有许多其他的着丝粒-动粒蛋白在敲降PML或DAXX后未进行免疫荧光信号定量分析。Coiled-coil结构域介导的同源二聚化过程是PMLNBs形成的先决条件,coiled-coil结构域缺失造成PML-NBs无法正常装配,而人为引入能够介导二聚化的PHR结构域并经过蓝光激活后则恢复了PML组装成核体的能力。