论文部分内容阅读
植原体(Phytoplasma)是一类原核专性寄生生物,无细胞壁、人工培养条件严苛、存在于植物韧皮部的筛管细胞以及具有刺吸式口器昆虫的肠道、唾液腺等部位内,能够引起水稻黄矮病(Rice Yellow Dwarf)、枣疯病(jujube witches’broom)、樱桃X病(Cherry X-Disease)、花生丛枝病(Peanut Witches’broom)、花生花变叶病(Sesame Phyllody)、泡桐丛枝病(Paulownia Witches’broom)、甘蔗白叶病(Sugar Cane White Leaf)等多种病害。樱桃(Prunus pseudocerasus L.G.Don)是四大樱桃栽培种之一,其果实具有特殊风味,在我国南方山地地区广泛种植,具有重要的经济价值。在重庆市綦江区多处樱桃种植区域观察到由樱桃花变叶植原体引起的病害发生,主要表现出樱桃花变叶(绿)(Phyllody,virescence)、僵果(stiff fruit)的典型症状,并伴有小叶丛生(leaflet clusters)、植株早衰(plant decline)直至死亡,病害覆盖率高达40%。国内外有关樱桃植原体病害的分子机制少有报道,关于植原体病害引起僵果的机制研究尚属空白。本研究选取感病植原体病害的樱桃植株为试验材料,将健康植株作为对照,利用形态学、分子生物学研究方法,通过16s r RNA测序对其致病植原体进行了鉴定与分析,结合转录组学与代谢组学,对感病果实及僵果果实进行了比对研究。以期解析樱桃植原体病害引起僵果形成的机制,为进一步研究樱桃植原体抗性种质和樱桃植原体防治方案甚至其它植原体病害发生机制与防治提供重要的理论支持,对于我国樱桃产业的进一步发展具有重要的科学意义。主要研究结果如下:1.樱桃僵果的转录组分析结果转录组分析结果表明,差异表达基因在病原体抗性和信号或调节功能两个方面有很高的比例。大量植物激素信号转导途径内基因在僵果中显著上调,生长素信号转导途径中包含上调表达基因(IAA4,9,14,31,SAUR20,32,71,72,GH3.1,3.17,ARF5,9)和下调表达基因(AUX22,IAA11,12,16,26,26,27,SAUR24,40,50,GH3.9,3.10,ARF3);水杨酸信号转导途径中包括显著上调的TGA10,PRB1和PR1A等,脱落酸信号转导途径中包含PYL4下调表达,PYL8,PYL2,PP2CA和Sn RK2.3上调表达等;其余植物激素信号转导通路内仅个别基因差异表达。2.樱桃僵果的广泛靶向代谢组分析结果差异积累代谢物在病原体抗性和信号或调节功能两个方面有很高的比例。代谢组分析结果表明,苯丙氨酸代谢及黄酮类物质合成在僵果中显著上调,上调的代谢物质包括鼠李糖甙(Biorobin)、5-氨基戊酸(5-Aminovaleric acid)、鸟氨酸(L-ORNITHINE)、紫云英苷(Astragalin)、脱落酸((+)-Abscisic acid)、芦丁(Rutin)等;下调的代谢物质有顺式玉米素(cis-Zeatin)、二乙醇胺(Diethanolamine)、帽柱叶碱(Mitraphylline)、月桂烯(Myrcene)、吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid)、夏佛塔苷(Schaftoside)等,大量的差异累计代谢物与植物抗性有直接关联。对植物激素的相对定量结果显示,僵果的生长素含量显著低于健康果实,而水杨酸和脱落酸则相反。3.qPCR验证及组学联合分析选择了与植物激素信号转导和植物免疫机制密切相关的四十四个差异表达基因,涉及了水杨酸信号转导途径、生长素信号转导途径、脱落酸信号转导途径及细胞分裂素信号转导途径,以验证RNA-seq数据的可靠性。q PCR结果显示,除了基因SAUR71和AREB3之外,q RT-PCR数据表现出与转录组测序分析结果的基因表达相同的趋势(42/44,95.45%),表明该部分基因的转录组测序数据及差异表达分析分析结果有良好的可靠性。僵果形成的机制主要是由植物生物胁迫反应通过植物激素信号转导诱导的,特别是水杨酸、生长素和脱落酸的信号转导途径。值得注意的是,植原体胁迫反应和干旱胁迫反应的差异表达基因之间有很大的重叠。此外,植物激素的含量显示出明显的差异,感染植原体的樱桃果实的脱落酸和水杨酸含量高于健康果实的含量,而玉米素、茉莉酸和生长素的结果则相反。经过实时荧光定量多聚核苷酸链式反应验证验证(quantitative Real-Time PCR),包括AHK2、IAA4、IAA9、IAA14、IAA31、ARF5、ARF9、GH3.1、GH3.17、SAUR20、SAUR32、SAUR40、PR1a、PRB1、TGA10和Sn RK2.3是导致樱桃僵果的关键候选基因。总之,本研究为了解植原体病害、樱桃僵果的分子机制、更好地理解果实的发育奠定了基础,同时也发现了与樱桃僵果有关的潜在候选基因,可供相关领域的研究者进一步使用。