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实验一弹性蛋白酶抑制剂西维来司钠对大鼠脑缺血再灌注损伤作用的实验研究背景与目的:缺血性脑血管疾病是老年人常见病、多发病,亦是导致老年人死亡和致残的主要疾病。近年来大量体内外实验及临床研究资料表明,脑缺血再灌注继发性炎症反应与中性粒细胞即多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte,PMN)的活化有关[1]。脑组织受到缺血刺激后,PMN活化并释放一种弹性蛋白酶,即中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)。该酶参与弹性蛋白、纤维蛋白、蛋白多糖等细胞外基质主要构成成分的降解过程,并促进中性粒细胞向内皮迁移及与内皮的黏附过程[2],引起血管内皮细胞和组织损伤。西维来司钠(sivelestat sodium hydrate,ONO-5046)在临床上主要用于治疗多种原因引起的急性肺损伤及其由于急性肺损伤导致的呼吸窘迫综合征[3],是目前作用于弹性蛋白酶途径唯一临床应用的药物[1]。研究发现[5-10],ONO-5046可以减少肝、心肌、脊髓等缺血再灌注后中性粒细胞的浸润,抑制NE的活性,减少炎性介质的产生,改善能量代谢障碍等,对这些组织、器官的缺血再灌注损伤有显著的保护作用,但是有关ONO-5046对全脑缺血再灌注(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIR)损伤作用的研究甚少。由于脑缺血与肝、心肌缺血引起的组织损伤有许多相似之处,都有组织的炎症、水肿以及局部血流的变化。我们可以推测,ONO-5046可能对脑缺血也具有保护作用。本实验旨在通过研究大鼠CIR后,给予ONO-5046干预对脑组织神经元损伤是否有保护作用及可能的作用机制,以期为缺血性脑血管疾病寻找一种新的治疗途径。方法:SD大鼠,随机分为假手术组、模型组和ONO-5046处理组,ONO-5046组根据给药量不同分为低、中、高三个亚组,给药量分别为3、10、30 mg/kg·d。采用经典的夹闭双侧颈总动脉伴全身低血压法全脑缺血模型,缺血20min,再灌注24h。ONO-5046组于再灌注时经股静脉持续给药24h,假手术组和模型组以同样方式给予等量生理盐水。ELISA法检测NE含量;观察脑组织含水量及脑组织病理学改变;分光光度法测定丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)和髓过氧化物酶(MPO)的活性;免疫组化法测定大鼠核转录因子-κB(NF-κB)和脑肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达。结果与结论:(1) ONO-5046能抑制脑缺血再灌注后脑组织NE的释放,减轻脑水肿发生并呈剂量依赖性;同时ONO-5046能减轻脑细胞的病理损伤,表明ONO-5046对大鼠CIR损伤有保护作用。(2) ONO-5046能降低CIR后大鼠MPO活性;阻止缺血再灌注引起的脑内MDA含量的升高和SOD活性的降低;能降低缺血引起的大鼠脑组织NF-κB和TNF-α表达的增加。表明ONO-5046可能通过提高脑组织自由基清除能力以及抗PMN的聚集、释放炎症介质等机制实现对CIR引起的组织损伤发挥保护作用。实验二西维来司钠对脑缺血大鼠全脑蛋白质组的影响目的:(1)利用双向凝胶电泳(2-DE)技术对大鼠脑缺血再灌注损伤(CIR)模型与给予中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂西维来司钠(sivelestat sodium hydrate, ONO-5046)干预的蛋白质表达谱进行比较;用PDQuest7.4.0分析软件对2-DE图谱进行差异表达分析,获取目标蛋白点。(2)对2-DE图谱上的部分差异蛋白点进行酶解,经HPLC-Chip-MS/MS纳流液-质联用技术进行序列分析,经Spectrum Mill搜索NCBInr数据库后鉴定蛋白质,寻找与脑缺血相关及ONO-5046起效的靶蛋白,从蛋白质组学层面探讨脑缺血的病理机制及ONO-5046治疗脑缺血损伤的作用机制。方法将清洁级SD大鼠9只,体重2250～300 g,随机分为3组,每组3只,分别为假手术组、模型组、ONO-5046组。模型组和ONO-5046组采用夹闭双侧颈总动脉合并低血压法建立全脑缺血模型,缺血20 min,再灌注24 h。ONO-5046组于再灌注时间点经股静脉持续24h输注ONO-5046生理盐水溶液,用药量为30mg/kg;假手术组和模型组给予等量生理盐水。再灌注24h后,大鼠断头取脑,切取右侧大脑后二分之一,迅速称重,提取总蛋白,Bradford法测定蛋白质浓度,然后-80℃冰箱冻存。取各组脑组织蛋白进行双向电泳,以固相pH梯度等电聚焦(IPG-IEF)为第一向,垂直平板十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)为第二向进行2-DE,银染法对电泳后的凝胶进行染色,采集凝胶图像并进行图像分析,寻找有意义的差异蛋白点,对部分差异蛋白质点进行酶解和质谱(mass spectrometry,MS)鉴定。结果:(1) pH3-10非线性IPG胶条对各组蛋白质分析,均成功获得了分辨率和重复性好的大鼠脑组织蛋白2-DE图谱。(2)利用PDQuest7.4.0图像分析软件对2-DE凝胶蛋白点进行分析,假手术组中检测到(989±22)个蛋白点,模型组为(1043±34)个,ONO-5046组为对照组为(1027±29)个;模型组与假手术比较有21个差异蛋白点,其中在模型组中新出现2个,上调8个,下调11个;ONO-5046组与模型组比较出现15个差异蛋白点,其中ONO-5046组上调的9个,下调的6个。(3)经质谱鉴定最终获得了丝氨酸蛋白酶-1、热休克蛋白71亚基、苹果酸脱氢酶、果糖二磷酸醛缩酶、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶、硫氧还蛋白过氧化物酶-1、腺苷酸激酶同工酶-1及磷脂酰乙醇胺结合蛋白-1 8个差异蛋白点相关信息。结论:利用pH3-10的IPG胶条以IPG-IEF为第一向,SDS-PAGE为第二向对大鼠全脑蛋白质进行2-DE能够获得较为理想的2-DE图谱;大鼠脑缺血后脑组织蛋白质表达存在明显差异,西维来司钠可通过调节有关蛋白质的表达,参与大鼠脑缺血神经元保护作用。