长期、大量使用抗生素造成兽医临床肠道共生菌及动物源性致病菌耐药现状越来越严重，尤其是细菌的多重耐药性给临床用药带来了巨大挑战。本研究对临床分离的24株对环丙沙星表现不同敏感性(5株高耐、13株耐药、6株敏感)的大肠杆菌进行喹诺酮耐药决定区(Quinolone Resistance Determining Region，QRDR)突变情况、质粒编码的喹诺酮类耐药基因(Plasmid Ediated Quinolone Resistance，PMQR)携带情况、外排泵AcrAB-TolC及其调控因子表达情况进行检测，进一步探讨大肠杆菌外排泵与其它耐药机制之间的联系。　　1、耐环丙沙星大肠杆菌耐药机制的研究实验室保存的24株对环丙沙星表现不同敏感性的大肠杆菌PFGE鉴定结果显示，23株分型成功，共有21种不同的PFGE谱型，这表明本实验所选菌株具有不同的遗传背景，是非克隆传播。　　本研究采用PCR的方法检测喹诺酮类作用靶位GyrA/B、ParC/E的编码基因QRDR突变情况和携带的质粒介导喹诺酮类耐药基因(PMQR)；通过有机溶剂耐受性实验(Organic Solvent Tolerance，OST)检测各大肠杆菌AcrAB-TolC外排泵的活性大小。结果表明，QRDR基因的突变主要集中在常见双突变GyrA(Ser83Leu和Asp87Asn)和ParC(Ser80I1e)；检测的不常见的突变有：ParC亚基的Ala56Thr、Ser57Thr、Glu84Gly、Glu84Lys；GyrB亚基的Ser492Asn；ParE亚基的Ile355Thr、Ser458Ala、Glu460Ala；耐药菌株中，靶位基因突变呈现多样化，并且外排泵外排作用增强。PMQR基因中oqxA检出率最高(15/24)，其次是aac(6)-Ib-cr(5/24)，3株qnr S1，仅1株检出qnrB6.没有检测到qnrA、qnrC、qnrD、qepA等基因。综合超广谱β-内酰胺酶(Extended spectrumβ-lactamase，ESBL)携带情况分析发现，16环丙沙星耐药株和1株环丙沙星敏感株同时携带ESBLs和PMQR基因；OST试验结果显示上述17株菌外排作用增强。这表明外排泵与染色体靶位突变及质粒编码耐药基因的携带可能存在一定的联系。　　2、外排泵AcrAB-TolC及其调控因子表达水平检测采用实时荧光定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)的方法检测24株菌株外排泵基因acrA、acrB、tolC，外排泵正调控蛋白编码基因marA、soxS，及膜孔蛋白基因ompC、ompF的表达水平；并通过PCR方法检测负调控基因acrR、marR、soxR突变情况。结果显示，耐药菌株AcrA、AcrB、TolC、MarA、SoxS的表达水平较高，而膜孔蛋白OmpC和OmpF的表达水平降低甚至缺失。acrR基因突变检测发现，除一株(ED28)耐药菌acrR存在777bp插入片段外，其余耐药菌株菌没有发现突变。ED28菌外排泵AcrA表达量提高4倍、AcrB表达量提高3倍，膜孔蛋白OmpC缺失，表现多重耐药。soxR基因中，仅一株(ED40)存在soxR T38S和G74R突变，外排泵AcrA表达量提高2倍、AcrB表达量提高4倍，膜蛋白OmpC缺失，表现多重耐药，其余菌株均没有检测到soxR突变。提示acrR插入突变及soxR T38S和G74R氨基酸替换可能导致外排泵表达水平提高和膜孔蛋白表达量降低。　　3、大肠杆菌acrR插入序列对acrAB表达水平及多重耐药性的影响本实验将野生型acrR通过互补实验导入ED28中得到C-ED28，并且通过MIC、OST和RT-PCR验证C-ED28菌株中AcrAB外排泵的活性；通过PCR方法检测ED28和C-ED28 QRDR突变及PMQR和ESBL基因携带情况。结果表明，临床分离菌株ED28对多种抗生素耐药，C-ED28则恢复了对大部分药物的敏感性。当CCCP存在时，ED28对喹诺酮类和β-内酰胺类药物的MIC普遍降低，而C-ED28的MIC保持不变。ED28对染料EB的MIC为512μg/mL，对有机溶剂耐受；C-ED28对染料EB的MIC为16μg/mL，对机溶剂耐受性呈阴性。RT-PCR结果显示，基因acrA和acrB在C-ED28中的表达水平低于亲本菌株ED2。PCR结果显示，ED28存在GyrA(Ser83Leu和Asp87Asn)和ParC(Ser80I1e)双突变，携带aac(6’)-Ib-cr、blaCTX-M-27和blaTEM-1三个质粒编码耐药基因；而C-ED28仅存在GyrA(Asp87Asn)一个突变位点，并丢失aac(6’)-Ib-cr、blaTEM-1两个质粒耐药基因。这表明777bp插入片段导致外排泵AcrAB过量表达；外排泵可能与质粒携带存在相互促进作用。