论文部分内容阅读
目的:多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是以中枢神经系统(CNS)白质的脱髓鞘病变作为特点,遗传易感个体与环境因素共同作用发生的自身免疫性疾病。其病因和机制尚未完全明确,但目前发现一些炎性细胞因子是导致其发生的主要原因。各种细胞因子以自分泌或者旁分泌的形式,参与该疾病免疫反应和组织修复过程,并且对多发性硬化病情的严重程度和发展起决定性作用。实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是一种以特异性致敏的CD4+T细胞介导为主,以中枢神经系统内小血管周围出现的单个核细胞浸润及髓鞘脱失为特征的自身免疫性疾病,是人类多发性硬化(MS)病研究的理想动物模型,对研究临床神经免疫学具有重要意义。芬戈莫德(fingolimod,FTY720)是从冬虫夏草中提取的有效成分-多球壳菌素(myriocin,ISP-1)通过去除手性中心、改变侧链等处理而合成的新型免疫抑制剂。FTY720的免疫抑制主要通过激动鞘氨醇-1-磷酸盐(sphingosine-1-phosphate,S1P)受体起作用,在体内主要经鞘氨醇激酶2的作用转化成单磷酸酯化合物(FTY720-P)进而发挥作用。并且,不同于其他用于治疗MS的药剂,FTY720独有的亲脂特性可以使它轻松的进入中枢神经系统。本实验以芬戈莫德作为干预药物,观察EAE小鼠及应用芬戈莫德治疗后小鼠的发病率、发病的严重程度以及芬戈莫德对其病程的影响。研究芬戈莫德对EAE小鼠表达促炎或抑炎细胞因子IL-17、TGF-β、RORγt、FOXP3的影响以及FTY720是否可以减轻EAE小鼠脊髓组织中的炎性浸润程度,进而研究芬戈莫德是否对EAE起保护作用。方法:将60只周龄在8至10周,体重为18g至20g的雌性C57BL/6小鼠,随机分成control组、EAE组和FTY720组,各组分别为20只。以为抗原建立EAE动物模型。FTY720组小鼠自EAE免疫当天起,给予FTY720 0.3mg/kg每日灌胃;control组及EAE组小鼠自EAE免疫当天起,给予等量的生理盐水每日灌胃。从免疫第1天开始,采用双盲法每日早晚(8:00和16:00)两次由两名观察者分别对小鼠进行称重、神经功能评分(采用weaver 15分法)直至处死。于免疫后第20天,相当于小鼠发病高峰期,处死小鼠。从control组、EAE组、FTY720组分别取15只小鼠,断颈处死,在冰盘上迅速取出脑、脊髓,液氮速冻后,置于-80℃冰箱保存,利用实时定量PCR方法检测脊髓中IL-17、TGF-β、RORγt、FOXP3表达水平。从control组、EAE组、FTY720组分别取5只小鼠用4%多聚甲醛灌注固定后取脊髓腰膨胀大部分,经固定、冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、粘片等过程后制成石蜡切片,进行HE染色观察炎性细胞浸润情况。实验数据采用SPSS13.0软件进行分析,计量资料均以均数±标准差表示(x±s),多组计量资料均数的比较应用ANOVA方差分析,P<0.05具有统计学意义。计量资料均数的组间比较应用snk-q检验,P<0.05具有统计学意义。发病率以百分数表示,各组间发病率的比较采用卡方检测,P<0.05具有统计学意义。结果:1 FTY720组发病率较EAE组显著降低(P<0.05)。2 在发病第20天,FTY720组平均神经功能评分均较EAE组显著降低去(P<0.05)。3 各组小鼠脊髓组织中IL-17、TGF-β、RORγt、FOXP3表达水平:在发病20天时,与Control组相比,EAE组IL-17、RORγt水平均增高,并有统计学差异(P<0.05);与EAE组相比,FTY720组IL-17、RORγt水平均降低,并有统计学差异(P<0.05)。在发病20天时,与Control组相比,EAE组TGF-β、FOXP3水平均降低,并有统计学差异(P<0.05);与EAE组相比,FTY720组TGF-β、FOXP3水平均增高,并有统计学差异(P<0.05)。4 HE染色:在发病20天时,与Control组相比,EAE组和FTY720组小鼠脊髓组织中的炎性细胞浸润数明显增多,并有统计学差异(P<0.05);与EAE组相比,FTY720组小鼠脊髓组织中的炎性细胞浸润数明显减少,并有统计学差异(P<0.05)。结论:1 FTY720可以降低EAE小鼠发病率,延迟EAE小鼠发病的起始时间,减轻神经功能损伤的严重程度,促进神经功能的恢复,对EAE小鼠具有保护作用。2 FTY720可以增高EAE小鼠脊髓组织中抗炎细胞因子TGF-β、FOXP3的表达水平,并降低EAE小鼠脊髓组织中促炎细胞因子IL-17、RORγt的表达水平。3 FTY720可以减轻EAE小鼠脊髓组织中的炎性浸润,减轻了EAE小鼠炎症反应程度。