人乳头瘤病毒(Human Papillomaviruses,HPV)属于乳头瘤病毒科、乳头瘤病毒属,是一类具有蛋白衣壳的双链DNA病毒。HPV病毒可分为200多个亚型,高危型HPV的感染将大大增加女性罹患宫颈癌的概率。宫颈癌号称女性第二大杀手,仅次于乳腺癌对女性的杀伤力。另外,HPV的感染也可能导致生殖器癌、口腔癌、咽喉癌,及生殖器疣等疾病的产生。L1蛋白HPV病毒上的主要衣壳蛋白,占HPV衣壳蛋白总比例的80%至90%,能自组装成类病毒颗粒,具有良好的免疫原性。现上市的HPV疫苗均以L1的类病毒颗粒为基础研制。但L1蛋白具有较强的型别特异性,对研发广谱的HPV疫苗造成了一定的困难。L2蛋白是HPV病毒上的次要衣壳蛋白,与病毒感染、入核、以及成熟后组装等过程有关。L2蛋白上含有HPV的广谱综合表位,且型别特异性较小,具有诱导机体产生交叉综合抗体、提供交叉保护的潜能。因此,解析L2蛋白的结构对更深入地研究HPV的感染机制以及研发HPV的广谱疫苗具有重要的意义。为了研究L2的结构与功能,本研究首先开展了在杆状系统中表达L1与L2相互作用的VLPs的工作。分别通过共感染与共表达路径进行表达,此时的L1与L2蛋白上均不含相互作用位点。经鉴定,两条路径表达的VLPs均由L1蛋白组成,未鉴定到L2蛋白的存在。通过细胞沉淀中的包涵体鉴定发现,L2蛋白存在于包涵体中。由此能够推论:L1、L2蛋白在昆虫细胞中同时表达后,未能有效相互作用。后续本研究在L1与L2上分别引入了半胱氨酸点突变,期望两个半胱氨酸位点能形成二硫键,增强相互作用。随后将蛋白L1-Q317C与L2-E338C同时表达,结果显示,在共感染路径表达的VLPs中,可检测到L2蛋白,但含量极少。本研究继续通过HPLC比较了不同VLPs的出峰时间并推论出,发现颗粒中L2的含量虽少,却能增大VLPs的直径。相互作用位点的引入是具有一定的效果。免疫原性评价的结果显示,此VLPs的免疫未能诱发小鼠体内产生高滴度的L2中和抗体。这可能与L2在HPV大部分的生命周期中均存在于五聚体内部、极少暴露中和位点有关。由于上述获得的VLPs并不均一,不利于冷冻电镜结构解析,本研究进行了L1与L2蛋白相互作用的五聚体的表达工作。经SDS-PAGE/WB/HPLC/TEM鉴定后,确认可在杆状系统中表达经175位与428位双点突变的16L1蛋白,且此蛋白具有自组装形成HPV-L1五聚体的能力。除了L2-E338C,我们根据本实验室其他课题方向的研究结果,在L2蛋白上引入了新的突变位点——T421C,以期能更好地加强L1与L2蛋白的相互作用。但从鉴定结果发现,旧相互作用位点与新相互作用位点的作用效果均不明显,共表达L1与L2形成的五聚体中不含L2蛋白。第三部分,本研究通过截短表达L2部分功能域蛋白。第一轮截短后,本研究首先通过Co柱对截短的L2蛋白进行了纯化。鉴定结果显示,洗脱样品中杂蛋白含量太高,难以用于结构解析及疫苗生产。本研究继续尝试第二轮的L2蛋白的截短,使用不同的载体和截短长度,最后用Co柱对其中六个截短蛋白进行了纯化。鉴定结果显示,L2-140-340蛋白具有最佳的纯化效果,洗脱样品中杂蛋白较少,L2含量很高,纯度较高,可能以三聚体或单体的形式存在。后续将继续研究该截短L2蛋白的生物性质和活性,获得均一的L2蛋白用于结晶和结构解析。