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西藏开菲尔(Kefir)是以鲜奶为原料,以开菲尔粒(Kefir grains)为发酵剂发酵的一种发酵乳,放在常温下可长期保存不变质,因此研究其抑菌活性物质基础,具有一定理论意义与应用价值。本文以西藏Kefir为原料,采用抑菌活性跟踪方法分离Kefir中抑菌活性多肽,并对其纯化所得单体进行抑菌效果、结构和抑菌机理研究。
1、西藏Kefir中抑菌活性物的提取及粗提物抑菌效果的研究。对蒸馏水分离得到的Kefir粗提物进行抑菌活性分析。结果表明:Kefir提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌、黄曲霉和啤酒酵母均有明显的抑制效果,最小抑菌浓度(MIC)在6.25 mg/mL～12.5 mg/mL之间,与尼生素相比,抑菌效果相当,抑菌谱更广,粗提物的抑菌活性能耐受110℃高温20 min和各种光照影响。
2、粗提物中抑菌肽的纯化。用琼脂扩散法检测抑菌活性,Tricine-SDS-PAGE电泳及茚三酮纸层析法鉴定纯度,跟踪纯化过程。葡聚糖凝胶Sephadex G-100层析得到SP-Ⅰ,SP-Ⅱ和SP-Ⅲ三个组分,抑菌活性大小为,SP-Ⅱ＜粗提物＜SP-Ⅲ。SP-Ⅲ经DEAE-52纤维素阴离子柱层析分离,得到W-Ⅰ、Y-Ⅰ、Y-Ⅱ和Y-Ⅲ四个活性组分,W-Ⅰ抑菌活性最强。建立高效液相(HPLC)分析方法后结合中压柱层析分离制备得到活性最强组分W-Ⅰ-2,经HPLC分离后得到FXKJT-1,FXKJT-2,FXKJT-3三个单一活性组分。
3、活性组分FXKJT-1抑菌效果研究和结构解析。选择琼脂扩散法与刃天青显色法两种方法对比Nisin研究抑菌效果强、含量多的FXKJT-1的抑菌效果,结果显示:Nisin对大肠埃希氏菌的MIC为6.25 mg/mL,对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的MIC均为3.13 mg/mL。FXKJT-1对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的MIC均为1.56mg/mL,对枯草芽孢杆菌和啤酒酵母菌MIC均为6.25 mg/mL,对黄曲霉菌的MIC为12.5 me/mL。用Edman降解法测定FXKJT-1和FXKJT-3的一级结构,FXKJT-3的氨基酸序列为:Apr-Ser-His-Met-Glu-Arg-Val-Leu,但未能测出FXKJT-1的氨基酸序列。经氨基酸自动分析仪检测得到FXKJT-1的氨基酸组成为:Phe、Ala、Leu、Glu、Asp、Arg、Val、Tyr、Pro、Thr、Gly、Ser、Ile、Lys,Cys,Met和His,推断FXKJT-1可能为焦谷氨酸化所致N端封闭或环肽。
4、FXKJT-1抑菌机理初步研究。测定FXKJT-1作用前后大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的生长曲线,通过电镜观测、细胞磷代谢、紫外吸收物测定及蛋白质检测,研究FXKJT-1对大肠埃希氏菌的作用机制。结果显示:FXKJT-1(1.56 mg/mL)有效抑制了两种菌的生长;FXKJT-1作用于大肠埃希氏杆菌后,大肠埃希氏菌对数期被无限期延长,抑制大肠埃希氏菌的生长代谢、细胞菌体结构物及蛋白的合成,降低细胞膜的通透性,致使菌体内容物外泄而凋亡。