论文部分内容阅读
本研究通过电子克隆和RT-PCR首次获得了猪LMP2、MECL-1基因的全长cDNA序列，LMP2基因全长为903bp (GenBank注册号：DQ295031)，含有一个661bp的完整开放阅读框，编码219个氨基酸。MECL-1基因序列全长985bp(GenBank注册号：DQ444460)，包含一个822bp的开放阅读框，编码274个氨基酸。BLAST软件进行同源性分析表明猪LMP2基因与人、小鼠、大鼠基因相似性分别为88.6％、83.2％、80.1％；猪MECL-1基因序列与人、小鼠、牛的基因序列分别有82.6％、76.2％、89.2％的相似性。
通过Q-PCR和．RT-PCR定量方法，检测了猪LMP2、MECL-1基因的组织表达谱，结果表明LMP2基因在心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺、小肠、胸腺、淋巴结、大脑9种组织中均表达，但在肌肉中无表达外；MECL-1基因在以上10种组织中均有表达。利用RH辐射杂交板将猪LMP2基因定位在猪7号染色体的7q1.1区域，与微卫星SW472紧密连锁(LOD=8.71，47cR)；MECL-1基因定位在猪6号染色体上，与微卫星SW1108紧密连锁(LOD=4.09，84cR)。
将猪LMP2、LMP7基因cDNA序列在GenBank中比对，获得了一个猪DNA序列克隆BX323833.4，比较分析后确定这两个基因内含子与外显子的分界点，以两端外显子设计扩增内含子的上下游引物，最终获得了LMP2基因5090bp的基因组序列(GenBank注册号：DQ659151)和LMP7基因2995bp的基因组序列(GenBank注册号：D0872631)。猪LMP2基因含有6个外显子和5个内含子，猪LMP7基因含有7个外显子和6个内含子。
本课题以长白猪(83)、大白猪(195)和松辽黑猪(89)共计367头仔猪为研究对象，检测了三群体在20日龄、35日龄的血常规、淋巴细胞亚群等免疫指标，并采用SSCP方法筛选了LMP2、LMP7两基因所有外显子及部分内含子区域，期望寻找到影响这些免疫性状的单核苷酸多态性(SNPs)。结果共发现6个SNPs，其中5个为同义突变，1个为错义突变。运用SAS软件包中的混合模型对基因多态位点与免疫性状的关系进行了统计分析，结果发现LMP7基因外显子3上SNP位点(LMP7-3)与20日龄CD4<->CD8<+>相关显著；LMP2基因外显子5上SNP位点(LMP2-5)与35日龄CD4<+>CD8<+>、红细胞平均体积、红细胞压积相关显著；LMP2基因外显子2上位点(LMP2-2)与35日龄白细胞计数、单核细胞百分率、单核细胞百分率、红细胞平均体积、红细胞体积分布宽度；LMP7基因外显子3上SNP位点(LMP7-3)与35日龄粒细胞含量、红细胞计数相关显著：LMP7基因内含子6上SNP位点(LMP7-6)与35日龄红细胞体积分布宽度相关显著；LMP2-2与两次测定的红细胞平均体积筹值、红细胞体积分布宽度差值相关显著；LMP7-3与两次测定的红细胞计数差值、红细胞体积分布宽度差值相关显著；LMP7-6与两次测定的红细胞体积分布宽度差值、红细胞平均血红蛋白含量差值、红细胞平均血红蛋白浓度差值相关显著。进一步说明两抗原呈递基因LMP2、LMP7可作为猪抗病育种中与免疫性状相关的标记候选基因。