第一部分:Sufu在皮肤创伤修复中的作用及其机制研究背景:皮肤创伤修复是复杂的病理生理过程,涉及四个阶段:止血期;炎症期;涉及角质形成细胞、成纤维细胞和内皮细胞的迁移和增殖的增殖阶段;成纤维细胞被巨噬细胞激活并分化成肌成纤维细胞的长时间的最后的重塑阶段。这些过程需要各种细胞之间的动态协同作用,其中包括内皮细胞、血细胞、表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞。在外科手术、热灼伤及慢性溃疡中皮肤创面修复起着关键性作用,除了急性创伤外,慢性皮肤创伤如压疮、糖尿病足溃疡的发病率也在逐年上升。而老年人群中糖尿病、肥胖和心脑血管疾病的流行也在延缓皮肤创伤修复的进程。创伤修复的失败已经成为外科手术、烧伤或创伤患者的主要的临床负担,功能失调性愈合常常给个人和社会带来巨大的负担。因此,了解皮肤创面修复的分子和细胞学机制对于改善皮肤创伤的治疗和预防是至关重要的。Sufu(Suppressor of fused)是脊椎动物Hedgehog信号通路的抑制分子,也是Wnt/β-catenin等信号通路的负调控因子,它具有多种复杂的功能,不仅是正常组织发育的调节者,也能阻止恶性肿瘤的发生。因此,Sufu可能对皮肤发育发挥着重要作用。尽管Sufu具有生物学上的重要性,但是Sufu在皮肤创伤修复中的作用及作用机制目前尚不明确,因此,值得深入探讨和研究。目的:本研究主要观察Sufu对细胞功能的影响;观察表皮特异性过表达Sufu小鼠对创伤修复的影响,旨在对创伤修复的机制进行有益的尝试,并提供有参考意义的实验数据和结果。方法:1.为进一步研究Sufu对表皮和真皮细胞特性及皮肤创伤修复的影响,我们成功构建了表皮定位过表达K14-hSufu-eGFP的转基因小鼠,研究Sufu转基因小鼠和对照组WT小鼠的形态差异。2.通过体内实验(in vivo)研究皮肤创伤修复。在hSufuTG和WT小鼠背部皮肤创建全层切口创面,不同时间点定点观察并且拍照,通过H&E染色、Masson三色染色法观察伤口面积、上皮舌面及肉芽组织的改变。同时应用Western blot、qRT-PCR和免疫荧光深入探索Sufu影响该过程的主要机制。3.通过体外实验(in vitro)研究过表达Sufu在角质形成细胞、成纤维细胞中的作用。分别应用CCK8检测细胞增殖活性,伤口愈合实验观察细胞迁移情况,免疫荧光检测成纤维细胞在TGF-β1刺激下向肌成纤维细胞分化的能力,利用qRT-PCR分析基因的表达水平,利用Western blot分析蛋白的表达水平。结果:1.构建并验证过表达hSufu的转基因小鼠。通过PCR、Western blot和免疫荧光染色进一步验证。2.K14-hSufuTG小鼠表征差异:与野生型(WT)小鼠相比较,7日龄和7周龄TG小鼠的背部皮肤的真皮层显著减少,而皮下脂肪组织却显著增加。3.hSufuTG小鼠皮肤伤口愈合延迟。为了观察Sufu在皮肤创面修复中的作用,我们在hSufu TG小鼠和WT小鼠背部皮肤上创建全层皮肤伤口。在损伤后1,3,7和12天测量伤口的表面积。TG小鼠伤口面积大于WT对照组,说明TG小鼠创面愈合时间明显延迟。与愈合速度延缓相一致的是,在伤后第7天和第12天,TG小鼠出现明显延长的上皮舌。在伤后第12天进行的伤口切片的Masson三色染色显示TG小鼠创伤区域的肉芽组织区域明显大于WT对照组。由此可见,Sufu转基因小鼠的背部创伤修复过程较野生型的更为缓慢。4.Sufu过表达抑制表皮角质形成细胞的迁移和增殖。Sufu过表达抑制角质形成细胞迁移,hSufuTG小鼠的角质形成细胞的增殖能力比WT对照组小鼠弱。5.表皮过表达Sufu影响真皮。与WT小鼠的成纤维细胞相比,TG小鼠成纤维细胞的增殖能力增加。此外,与TG小鼠成纤维细胞相比,在TGF-β刺激后,WT小鼠成纤维细胞中α-SMA的表达明显增加。6.Sufu通过抑制Hh/Gli和Wnt/β-catenin信号通路来延缓伤口愈合。结论:Sufu在皮肤发育过程中调节表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞的细胞特性,并通过抑制Hh/Gli和Wnt/β-catenin信号通路来延迟伤口愈合。第二部分:Sufu在皮肤纤维化中的作用及其机制研究背景:硬皮病(SSc)是以皮肤和内脏器官纤维化为特征的自身免疫性疾病。SSc的发病机制涉及导致纤维化的自身免疫性、血管性和炎性改变的三联征。纤维化的病理机制是响应组织损伤而激活的复杂的生理病理过程。固有免疫和适应性免疫都参与到纤维化的发病机制中,免疫细胞的募集导致成纤维细胞活化并分化成肌成纤维细胞,接着导致细胞外基质沉积。截至目前,硬皮病并没有有效的治疗方法,它严重影响患者的生活质量和预期寿命,甚至导致严重的残疾和死亡。因此,深入研究硬皮病的病因及可能的治疗方法已经迫在眉睫。哺乳动物Hh信号通路在分子水平和机制上都是相对保守的。在脊椎动物中有三个Hh基因:Sonic(SHH),Indian和Dessert,其中SHH具有最普遍的作用。目前已经从小鼠和人类基因组中分别鉴定和克隆了单一的同源Sufu基因。Sufu由12个外显子组成,位于10q24这个肿瘤中常常缺失的区域,编码含484个氨基酸的蛋白。人类的Sufu在大多数成年组织中表达,并且在不同的发育阶段有不同的表现形式。Sufu作为Hh信号通路传导和肿瘤的负调控因子,同时也是脊椎动物Wnt/β-catenin和其他通路的负向调控因子。目前主要是应用博来霉素诱导的硬皮病模型来研究SSc的发病机理。在各种抗纤维化的药物和分子中,Sufu在皮肤纤维化中的作用及其作用机制尚未完全阐明。本研究旨在探讨Sufu在皮肤纤维化中的潜在作用及可能机制。方法:1.构建SufuTG小鼠和WT小鼠博来霉素诱导的硬皮病模型。博来霉素(BLM)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)皮下给药,通过皮肤厚度、皮下脂肪萎缩程度、肌成纤维细胞计数、炎症和真皮中的胶原等来评估皮肤纤维化。通过应用Western blot探索可能的机制。2.从WT和TG小鼠分离的真皮成纤维细胞在体外进行培养,用BLM刺激,通过qRT-PCR和Western blot比较纤维化相关基因和蛋白的表达。评估WT小鼠和TG小鼠的真皮成纤维细胞在BLM刺激后成纤维细胞活化和胶原合成的情况。结果:1.Sufu在BLM诱导的小鼠真皮成纤维细胞中表达下调。我们体外培养了正常WT小鼠的成纤维细胞,在BLM诱导后,Sufu的表达明显下调。Western blot的结果也进一步验证了上述结论。2.hSufu转基因小鼠抵抗BLM诱导的皮肤纤维化。PBS处理的WT小鼠和TG小鼠真皮厚度无差异,BLM的应用有效的诱导了小鼠皮肤增厚。SufuTG小鼠与WT小鼠相比,WT小鼠真皮厚度显著大于TG小鼠(2.02 fold versus 1.56 fold;302±58 μm vs.191±41.5μm,p<0.01)。类似地,TG 小鼠真皮中羟脯氨酸的含量(+376%的对照厚度)和TCS蓝色染色区域(13.6±1.0%vs.30.1±4.2%,P<0.01)表达的胶原蛋白含量均显著少于WT小鼠。TG小鼠皮肤厚度和胶原蛋白含量的降低同时伴随着α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)(肌成纤维细胞表型的标志)的表达的显著降低。此外,我们通过免疫组织化学染色显示了皮肤中α-SMA的表达,而TG小鼠真皮内肌成纤维细胞的增加相对少于WT小鼠。类似地,注射BLM的TG小鼠皮肤相对于注射BLM的WT小鼠皮肤具有更少的fibronectin和collagen Ⅰ的表达。这些数据表明,TG小鼠在BLM诱导的皮肤纤维化模型中可以有效抑制皮肤纤维化,表明Sufu是真皮纤维化发展中的重要介质。3.BLM诱导后,Sufu与真皮成纤维细胞活化和胶原合成相关联。我们进行了体外实验,观察BLM诱导后,WT小鼠和TG小鼠的真皮成纤维细胞的活化和胶原合成。在成纤维细胞中,BLM刺激诱导的fibronectin和collagen Ⅰ蛋白的表达水平来看,TG小鼠的表达相对更少。总体而言,TG小鼠成纤维细胞对BLM的反应性比WT小鼠的小。4.Sufu可能通过下调Wnt/β-catenin通路的活化,来抑制BLM诱导的皮肤纤维化。我们的研究发现Sufu有效的抑制了体内β-catenin的活化,这可能有助于在小鼠硬皮病模型中抑制皮肤纤维化的发生。TG小鼠β-catenin的基因和蛋白水平均显著下调。这表明Sufu过表达可能增加了 β-catenin的降解。结论:综上所述,我们的研究发现了 sufu可能通过下调Wnt/β-catenin通路的活化来抑制皮肤纤维化。本研究拓展了 sufu在纤维化疾病中的认识,可能为今后皮肤纤维化过程的研究和治疗提供新的思路。