【摘 要】
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金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,SA）是一种常见的食源性致病菌,可引起食物中毒、肺炎、心内膜炎以及败血症等多种感染性疾病,甚至危及生命。随着各种广谱抗生素在临床上大量不合理使用,导致多重耐药金黄色葡萄球菌的出现。因此,在合理规范使用抗生素的同时,也迫切需要开发与传统抗生素作用模式不同的新型抗菌药物。前期本课题组从飞龙掌血（Toddalia asiatica Lam.）中
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金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,SA）是一种常见的食源性致病菌,可引起食物中毒、肺炎、心内膜炎以及败血症等多种感染性疾病,甚至危及生命。随着各种广谱抗生素在临床上大量不合理使用,导致多重耐药金黄色葡萄球菌的出现。因此,在合理规范使用抗生素的同时,也迫切需要开发与传统抗生素作用模式不同的新型抗菌药物。前期本课题组从飞龙掌血（Toddalia asiatica Lam.）中分离得到白屈菜红碱（Chelerythrine,CHE）,研究证实这种生物碱具有良好的抑制金黄色葡萄球菌的生物活性,但作用靶标尚不明确。本研究通过对CHE作用于金黄色葡萄球菌的形态学研究,分子对接技术预测了CHE作用的一个靶标蛋白,通过遗传学与分子生物学结合生物表型,深入研究了Mnt C蛋白介导的CHE抗金黄色葡萄球菌的作用,转录组测序所得生物信息进行联合分析,深入探索CHE的作用机制。测定CHE对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径、最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。CHE初始浓度为2.94 m M时,抑菌圈直径分别为17.25 mm,18.58 mm和17.17 mm,MIC分别为45.93μM,11.48μM和22.96μM,MBC分别为183.71μM,22.96μM和91.86μM。在此基础上,以MIC为CHE作用浓度,观察细菌整体形态变化、测定电导率的变化、碱性磷酸酶含量的改变、代谢途径中葡萄糖消耗的变化、菌体可溶性蛋白谱带的变化和核酸的影响等,对CHE的体外抑菌机制进行研究。结果发现通过扫描电镜可以观察到CHE浓度越大,金黄色葡萄球菌的破碎程度越明显。电导率的变化率,碱性磷酸酶含量和葡萄糖的消耗均发生了明显的变化,菌体的可溶性蛋白条带在不同的时间有变化。而CHE与SA基因组DNA体外混合后进行电泳检测,发现没有明显的变化。为了探究CHE对金黄色葡萄球菌的作用靶标,测定了CHE作用前后Mn2+的消耗以及SOD活性的变化,发现在4 h时Mn2+消耗减少,SOD的活性降低。将CHE和Mnt C进行分子对接,对接结果显示,Glu-260、Lys-272、Thr-286为其结合的主要残基。将目的蛋白进行原核表达、纯化后,体外与CHE结合,紫外光谱和圆二色谱结果显示氨基酸残基发生变化。应用定点残基突变和荧光淬灭实验,验证CHE与Mnt C的结合位点。通过Overlap PCR分别将编码三个氨基酸的碱基进行突变,Thr-286突变后,结合常数降低明显。为进一步探究CHE的杀菌机制,构建mnt C缺失和回补体菌株,结合生物表征进行研究。结果显示,mnt C缺失体菌株对CHE产生了一定的抗性,扫描电镜显示,CHE对菌体的损伤减小,CHE作用于Δmnt C后菌体凹陷但未破碎,通过PI和DAPI进行荧光标记,Δmnt C红色荧光强度减弱,细菌死亡数量减少。流式细胞仪检测CHE对金黄色葡萄球菌的损伤,收集到WT细胞的荧光峰明显向右偏移,而Δmnt C的荧光峰位置与对照组相比基本一致。回补体在一定程度上恢复了对药物的敏感。表明Mnt C参与了CHE对金黄色葡萄球菌的杀菌作用。我们利用转录组测序技术对CHE作用前后的转录组数据进行比较,并通过实时荧光定量RT-PCR的方法对转录数据进行验证,生物信息学分析,确定CHE对金黄色葡萄球菌的作用关键通路为β-内酰胺抵抗通路、肽聚糖生物合成、二元信号系统、ABC转运体、DNA复制与蛋白质合成。综上所述,本研究表明,CHE具有显著的抗金黄色葡萄球菌活性,细菌细胞膜上的Mnt C是CHE的作用位点之一,Thr-286是关键结合位点。CHE可能通过ABC转运蛋白Mnt C运输穿过细菌的细胞膜,为金黄色葡萄球菌的抗菌和杀菌策略提供理论依据。
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