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建立了通过虚拟筛选得到的亲和配基,将胰蛋白酶定向的固定化到载体表面的新型固定化酶制备方法。通过对接软件Autodock4.0和FlexX对胰蛋白酶的目标位点进行对接筛选,得到以最低自由能对接到目标位点的五种小分子(蔗糖、2-硝基苯基β-D-葡糖苷、海藻糖、麦芽糖、纤维二糖),同时选定一种对接失败分子(乙二醇)作为阴性对照。通过色谱方法初步验证小分子对胰蛋白酶的亲和作用。色谱条件为:流动相流速0.3ml/min,进样量0.1ml。小分子在蒸发光散射检测器(ELSD)检测到的信号峰面积在与胰蛋白酶混合后,有明显降低,证明小分子与胰蛋白酶间存在吸附作用。建立制备偶联有五种亲和配基的亲和载体的方法。为降低配基和胰蛋白酶结合的空间位阻,在载体表面连接乙二醇二缩水甘油醚间隔臂,同时引入环氧基活化集团。活化反应条件25℃,170rpm,反应时间10h,活化环氧基密度达到51mmol/L以上。配基偶联至活化载体的反应条件40℃,170rpm,反应时间4h。经傅立叶变换红外检测可知,配基成功偶联到载体表面。通过实验方法得到酶和载体的最佳固定化反应条件(酶和载体量之比90mg/g,固定化时间4h),吸附效果最好的亲和载体为纤维二糖亲和载体,最高酶载量达9.43mg/g。
对制得的固定化胰蛋白酶活性进行测定,采用水解底物N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)法。2-硝基苯基β-D-葡糖苷亲和载体固定化的胰蛋白酶比活力最高,达到300.32U/mg,单位载体酶活达到340.77U/g,活性回收率达2.40%。