等钳蠊螨联苯肼酯抗性选育及抗性机制研究

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等钳蠊螨Blattisocius dentriticus为囊螨科蠊螨属捕食螨,是储粮害虫的重要天敌,同时还可以捕食田间多种害虫(螨)。虽然捕食螨捕食范围广,但该螨并不能捕食所有害虫,因此,化学药剂仍然是不可缺少的防治措施。而化学农药施的用就不可避免对捕食螨产生毒害作用,降低防效。筛选抗药性捕食螨可以有效的解决上述措施之间的矛盾。本研究在分析等钳蠊螨对柑橘全爪螨防治潜力的基础上,在室内使用联苯肼酯对其进行抗性选育,获得了低水平抗性品系;通过克隆技术,比较抗/敏品系细胞色素b基因的序列差异;进一步利用高通量测序技术,系统分析抗/敏感品系的差异表达基因;在此基础上,利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)技术对代谢解毒酶和靶标基因表达水平进行检测,以期从分子水平解释其抗性机制,为捕食螨的分子改造,尤其是抗性机理研究提供理论基础。本研究获得的主要结果如下:1.等钳蠊螨对椭圆食粉螨的捕食功能测定通过测定等钳蠊螨对椭圆食粉螨的捕食功能,发现其功能反应为HollingⅡ型,等钳蠊螨在16-28℃的范围内,其捕食能力随温度上升而提高,等钳蠊螨对椭圆食粉螨有较强的捕食能力,表明可以运用替代猎物法,利用椭圆食粉螨对等钳蠊螨进行大规模饲养。2.等钳蠊螨联苯肼酯抗性选育及生态适合度评价测定联苯肼酯对等钳蠊螨和柑橘全爪螨的毒性选择指数,其毒性选择指数为138.24,表明联苯肼酯对等钳蠊螨和柑橘全爪螨有高度正向选择性。等钳蠊螨对联苯肼酯的LC50由19315.54 mg/L提高到了116746.50 mg/L,其抗性倍数是敏感品系的6.04倍,达到低水平抗性。在此基础上,研究了等钳蠊螨联苯肼酯抗性品系对田间常用药剂的交互抗性。结果表明等钳蠊螨联苯肼酯抗性品系与烯啶虫胺、双甲脒和丁氟螨酯有交互抗性,其抗性系数分别为2.48、2.21和6.38倍;又进一步研究联苯肼酯抗性获得对等钳蠊螨对柑橘全爪螨雌成螨和卵捕食功能的影响,结果表明等钳蠊螨联苯肼酯抗性和敏感品系对柑橘全爪螨雌成螨和卵的捕食量没有显著的差异,在功能反应的各个参数中也没有较大的改变。表明联苯肼酯抗性筛选并没有影响等钳蠊螨对柑橘全爪螨的捕食功能。3.等钳蠊螨细胞色素b基因克隆与分析克隆获得了一条长度为1229bp cDNA序列,其开放阅读框为1083bp,编码360个氨基酸。通过比对发现该基因与西方盲走螨和智利小植绥螨的细胞色素b基因同源性较高,及将其命名为Bdbcytb。利用特异性引物和单头成螨DNA,对等钳蠊螨抗性品系成螨的细胞色素b基因潜在突变位点进行克隆和测序,并未发现突变,说明等钳蠊螨对联苯肼酯的低水平抗性可能与细胞色素b突变无关。利用酯酶、谷胱甘肽S-转移酶和多功能氧化酶三种解毒酶的抑制剂脱叶磷(DEF)、马来酸二乙酯(DEM)和胡椒基丁醚(PBO)对等钳蠊螨进行增效试验,发现DEM和PBO对联苯肼酯增效作用的抗敏增效比分别是1.74和1.69,相对增效系数分别是60.67和57.09,说明谷胱甘肽S-转移酶和多功能氧化酶参与了联苯肼酯的代谢解毒。4.等钳蠊螨联苯肼酯抗性和敏感品系基因表达谱差异分析本试验利用Illumina转录组测序技术对等钳蠊螨进行了转录组测序,通过组装得到了108572个转录本和75697个Unigene,得到34912个有效注释。等钳蠊螨联苯肼酯抗性品系和敏感品系表达谱分析,表明两个样本中有3076个差异表达基因,其中上调基因174个,下调2902个。在上调基因中,两条基因可能与抗性相关,其中一条是磷酸烯醇丙酮酸羧激酶相关基因(c20449.graphc0),另一条是UDP-葡萄糖基转移酶相关基因(c40332.graphc1)。5.等钳蠊螨抗性靶标及代谢相关基因表达差异分析通过实时荧光定量PCR验证了10条解毒酶基因和抗性靶标基因细胞色素b在等钳蠊螨联苯肼酯抗敏品系间的表达差异。结果发现,在抗性品系中,P450家族的CYP3A56和GST家族的GSTD1上调倍数最高,分别为为2.28倍和1.78倍(P<0.05)。在此基础上,又进一步验证了LC25、LC50和LC75三个浓度下处理12h、24h和48h条件下,上述基因在抗敏品系中的表达差异。结果显示,CYP3A56基因在LC50和LC75浓度浓度下处理12h、24h的表达量均出现显著上调(P<0.05);GSTD1基因在不同处理浓度和时间条件下,其表达量出现不同程度的上调(P<0.05)。此外,Bdbcytb基因在LC25以及LC50浓度下48h条件下,Bdbcytb在抗性品系中,表达量显著上调(P<0.05);结果表明这三条基因表达量上调可能与联苯肼酯抗性相关。
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