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研究背景人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)是引起获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS,又称为艾滋病)的病原体,HIV感染的潜伏期一般8-10年。传统免疫学方法检测抗HIV抗体,只能判断是否感染HIV,不能区分HIV新发感染,难以准确监测HIV流行趋势及评价干预措施的效果。基于横断面样本估算HIV新发感染率的实验室检测方法在近年来有一定的研究进展,但尚未有公认的金标准。本课题组前期研究发现HIV-1跨膜糖蛋白gp41中57氨基酸多肽(gp41-p57)能够区分HIV-1近期和长期感染,但具体的抗原决定簇氨基酸序列,以及HIV不同基因型氨基酸的差异对检测结果的影响,尚需进一步研究确定。研究目的研究gp41-p57多肽抗原在区分HIV-1近期和长期感染中起主要作用的抗原决定簇及其基因型特异性,初步建立基于我国流行的HIV-1基因亚型gp41抗原区分HIV近期和长期感染实验室检测方法,为HIV新发感染率的监测、预防或治疗措施的效果评价提供研究方法和工具。研究方法1.基于HIV gp41-p57序列,通过人工合成10条长短不一的系列短肽为检测抗原,以间接ELISA法研究其与HIV-1近期和长期感染样本的免疫反应特征,分析gp41多肽的抗原决定簇。2.合成源自我国流行的CRF01_AE、B、CRF07_BC和CRF08_BC四种亚型的gp41-p57多肽,以间接ELISA法研究其与HIV-1不同基因亚型感染样本的免疫反应特征,分析gp41-p57基因型特异性。3.构建原核表达载体,通过免疫印迹实验和间接ELISA法分析所纯化目的蛋白的免疫活性,获得包含HIV-1 CRF01_AE、B、CRF07_BC和CRF08_BC亚型gp41_p57的融合蛋白MP4。4.以融合蛋白MP4为检测抗原,建立区分HIV-1近期和长期感染的间接ELISA法,通过与商品化试剂盒LAg-Avidity EIA检测结果比较,评价所建立方法的灵敏度、特异度以及阳性预测值和阴性预测值。研究结果1.确定了HIV gp41-p57多肽中QKFLG和GKIIC序列是区分HIV-1近期感染和长期感染中起主要作用的抗原决定簇。p57多肽两端序列EAQQHLLQLT和WNSSWSN可能影响抗原抗体的识别或结合。基于p57多肽建立的方法与商业化试剂盒检测结果的一致率为0.923,约登指数为0.923,受试者工作曲线下面积为0.987。说明HIV-1 gp41-p57多肽可作为区分HIV-1近期感染和长期感染方法的检测抗原。2.HIV不同基因型的gp41_p57多肽序列存在差异,影响检测结果的灵敏度。将来自HIV-1优势基因型的gP41-p57多肽混合后作为检测抗原,可以提高检测方法灵敏度。3.与商业化试剂盒比较,基于融合蛋白MP4的检测方法对37份纵向样本和159份横断面样本的检测结果的一致率分别为0.890和0.730,灵敏度分别为90.91%和96.85%,特异度分别为100.00%和71.88%,近期感染预测值分别为88.24%和85.19%,长期感染预测值分别100.00%和85.19%。基于融合蛋白MP4的检测方法对159份样本重复检测三次,仅7份样本(4.40%)结果不完全一致,检测方法的可靠性为95.60%。研究结论本研究确定了区分HIV-1近期和长期感染的gp41多肽抗原决定簇及其基因型特异性。基于我国HIV主要基因亚型gp41抗原的融合蛋白MP4,初步建立了区分HIV-1近期感染和长期感染的间接ELISA法。