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生物可降解材料、药物靶向和缓释材料等可供选择的种类，难以满足日益发展的环境保护和药物治疗的需要。γ-聚谷氨酸(γ-PGA)因其良好的水溶性、生物降解性、生物相容性和安全无毒性，以及分子链上具有的高活性侧链羧基，易于发生交联、螯合和衍生化，在医药、食品、化妆品和农业领域具有广阔的发展前景和巨大的开发潜力。目前，亟需解决的是如何提高单位产量以降低成本，并实现对单体组成和分子量的可控性，这就要求从γ-PGA的生物合成途径进行深入研究。
本研究从发酵食品中分离到4株谷氨酸依赖型和1株非谷氨酸依赖型γ-PGA合成菌，通过16S rRNA和BIOLOG初步鉴定为：Bacillus licheniformis CDL-1，B．subtilis CDL-2，B．subtilis CDL-16，B．subtilis CDL-17和B．subbtilis CDL-19。利用紫外光谱扫描、TLC、1H-NMR、RT-HPLC和GPC等技术对发酵产物进行鉴定和分析，结果表明5株菌合成的γ-PGA产物中D-谷氨酸含量在5.80％～33.95％之间，重均分子量Mw为347 kD～443 kD，分散度为1.19～1.44。低D-谷氨酸单体含量、低分子量和分子量分布小的γ-PGA在医药、化妆品和食品领域具有很大应用价值。
本研究利用分子微生物学手段，对本室的谷氨酸依赖型B．licheniformisNK-03和谷氨酸非依赖型γ-PGA合成菌Bacillus sp.LL3产γ-PGA进行了深入研究。首先，采用特异性细菌促旋酶基因gyrA，将Bacillus sp.LL3进一步鉴定为B．amyloliquefaciens LL3，并首次克隆获得其γ-PGA合成酶基因pgsBCA。通过与B．amyloliquefaciens FZB42、B．subtilis168、B．licheniformis ATCC14580、B．pumilus SAFR-032等标准菌株的PgsBCA氨基酸序列比对发现，PgsB和PgsC具有94.35和94.09%高度同源性，而PgsA差异性较大，只有79.85%-致性。设计含有pgsBCA基因的表达载体pTrcpgs，以及pgsBCA、谷氨酸消旋酶基因racE的双基因重组载体pTrcRP，分别在E.coli JM109进行表达。在以葡萄糖或L-谷氨酸作为底物的LB(含Mg2+和Mn2+)培养基进行发酵，结果显示L-谷氨酸相对于葡萄糖为更好的底物，含LL3 pgsBCA的重组菌其γ-PGA产量高于NK-03，推测来源于LL3的PgsBCA比NK-03催化能力要强，较强的催化能力要求更多的L-谷氨酸底物供应；当培养基中提供足够的L谷氨酸时，聚合酶催化合成的γ-PGA差距明显缩小，这表明足量的底物供应可能比合成酶催化能力对高产γ-PGA更为重要，PgsBCA可能不是γ-PGA合成菌分型的决定因素。另外，通过穿梭载体pXMJ19将NK-03菌株的pgsBCA基因以原生质体方法转化谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC13032，在C.glutamicum生产L-谷氨酸的培养基中加入IPTG诱导后，可以合成产量为0.69 g/L、重均分子量（Mw）为73071、D-谷氨酸单体占3%的γ-PGA，实现了γ-PGA以糖类为底物的“一步法”合成。
以正交设计方法对B．amyloliquefaciens LL3发酵生产γ-PGA的培养基配方进行优化。分析结果表明，蔗糖对试验组影响最大、为最显著因子，最优组合为蔗糖50 g/L、(NH4)2S042g/L和MgS040.6 g/L，此时γ-PGA产量提高了3.2倍。在此配方基础上进行了30 L和200 L的体系放大，发酵过程中菌体生长、相对粘度、γ-PGA产量和蔗糖利用等过程参数呈现稳态变化，其中200L体系培养44h时γ-PGA最高产量为4.36 g/L，接近2g/L(NH4)2S04全氨基转移作用可能生成的量(4.46 g/L)，而(NH4)2S04可能成为限制放大发酵产量的关键因素。另外，采用苯酚硫酸法测定了LL3发酵生产γ-PGA时含有的多糖副产物成分占到了36%，于是尝试构建打靶载体，借助同源重组将多糖基因从LL3染色体中进行敲除。本研究已经扩增到胞外多糖合成关联基因epsA上下游同源区片段，并以pET30a Kanτ作为筛选标记，3个片段混合连接于pBluesenpt SK(-)质粒上，构建打靶载体pBSukd。目前在探索野生菌LL3的转化方法，期望借助epsA基因敲除后可能引起的代谢流改变，提高LL3合成γ-PGA的能力。