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绿色荧光蛋白(Green fluorescent proteins,GFP)是一种存在于海洋生物维多利亚多管水母中的极具生物医学应用价值的天然发光蛋白。GFP的核心发光元件是由对羟基苄基2,3-二甲基咪唑啉酮(p-hydroxybenzylidene-2,3-dimethylimidazolinone, p-HOBDI)构成的生色基，蛋白内大量分子间氢键围绕在p-HOBDI周围，将生色基限定为单一稳定构象，从而使蛋白在蓝紫光的激发下发出绿色荧光。为了对GFP进行生物仿生，拓展其应用范围，先后发现生色基类似物、富含氢键类蛋白质以及芳香肽类纳米结构等生物材料具有内在的荧光特性。其中，具有自发荧光性的多肽纳米颗粒由于结构简单、生物相容性好、合成简便、可自组装等诸多优点逐渐受到研究者的关注。然而，单一荧光色调和狭窄的应用范围等突出问题成为荧光多肽纳米材料在生物医学领域发展的主要瓶颈。为此，本文拟开发新型仿生荧光多肽材料，深度剖析其发光机制，并积极拓展其在分子示踪、生物成像、药物递送与病毒检测等生物医学领域的应用范围。
(1)设计开发彩虹色仿生荧光多肽纳米颗粒。
本论文从GFP及其突变体生色基结构获取灵感，系统构建了一系列仿生寡肽，将仿生多肽材料的荧光光谱范围拓展至蓝色、绿色、黄色、橙色和红色等可见光区域，有效地突破了瓶颈限制。由于广泛的分子间作用力和红边激发荧光位移效应(Red edge excitation shift, REES)，非荧光寡肽可自组装形成彩虹色荧光纳米颗粒，被称为多肽彩虹套装(Peptidyl rainbowkit, PRK)，展现出内在的光致发光效应。PRK寡肽在生理条件下具有与荧光蛋白可比拟的生物相容性和光稳定性。相比于GFP，PRK寡肽使用简便、成本低廉，展现出广阔的应用前景。上述特性将促进PRK成为可应用于生物医学领域的仿生荧光材料。
(2)阐释PRK荧光机制-聚集诱导发光。
采用粗粒度分子动力学模拟(Coarse-grained molecular dynamics,CG-MD)、系统的结构表征以及合理的实验等手段对PRK寡肽荧光发光机制进行深度阐释。研究结果表明，丰富的分子间氢键和疏水相互作用是PRK寡肽组装体产生荧光的主要原因。此外，模拟结果直观地阐释了多肽纳米材料的荧光机理，即分子间相互作用力限制了寡肽残基的分子内运动(包括分子内振动、转动等)，从而阻断了能量的非辐射构象弛豫等途径，最终产生聚集诱导发光现象。
(3)荧光多肽纳米颗粒用于实时监测核酸递送过程。
为拓展PRK应用范围，从病毒结构获取灵感，在PRK寡肽结构的基础上设计开发了非致病性多肽病毒样纳米颗粒(Peptidyl virus-like nanoparticles,pVLPs)，即将猿猴空泡病毒核定位序列和人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)第三可变区多肽(Thethird variable loop,V3)等两种具有生物活性的功能性肽段通过二茂铁-苯丙氨酸二肽(Fc-FF)共组装在一起，制备形成具有荧光特性的功能化pVLPs。研究结果表明，pVLPs在绿光光谱范围内表现出稳定的荧光特性，同时具有良好的生物安全性、生物相容性、光稳定性以及细胞穿透性，并在实时监测核酸的递送等应用上展现出优异的性能。
(4)理性设计多肽纳米颗粒用于核酸药物定向递送。
在上述研究的基础上，进一步根据艾滋病病毒表面囊膜蛋白(glycoprotein 120, gp120)上的第三可变区多肽与猿猴空泡病毒大T抗原蛋白分子的核定位序列(Nuclear localization sequence, NLS)，通过分子与纳米仿生，以及对病毒多肽的组装调控，成功制备仿病毒纳米颗粒pVLPs。该颗粒可携带核酸类基因药物，以类似病毒的跨膜方式将基因药物靶向运送至病毒易感细胞内。此外，该仿生病毒颗粒在基因递送过程中还展现出良好的生物相容性、生物活性以及定向运输性。
(5)仿生荧光多肽纳米颗粒用于长期稳定细胞成像。
基于PRK寡肽，成功构建具有聚集诱导发光性质的酪氨酸类(Fc-YY)荧光多肽。与GFP生色基光学性质相似，多肽纳米颗粒中，酪氨酸残基通过分子间氢键交织作用在一起，并在酪氨酸残基变为酚类阴离子时发出绿色荧光。当酪氨酸类多肽与HIV的GPGR多肽序列共价连接后，展现出细胞穿透和溶酶体逃逸等特性。生理条件下，共价连接的酪氨酸类多肽具有良好的光稳定性、pH响应性和生物相容性，在长时间活细胞成像方面具有优异的性能。
(6)仿生章鱼状DNA用于病毒检测。
为进一步拓宽PRK寡肽在生物医学领域的应用，从章鱼捕食过程获取灵感，构建了一种以pVLPs为基因载体的章鱼状DNA(Octopus-like DNA,OLD)，可应用于HIV-1基因的快速无酶检测和HIV感染过程中病毒核酸的可视化。该方法既适用于HIV基因片段的检测，也适用于单链基因组的检测，是一种快速HIV检测技术。该检测方法与设计思路可进一步应用于其他病毒类疾病检测。
综上所述，本论文从水母荧光蛋白发光现象获取灵感，构建多色系多肽荧光纳米颗粒PRK。PRK寡肽及其衍生物在生理条件下展现出良好的生物活性、生物相容性、光稳定性以及pH响应性，在生物分子示踪、基因药物定向递送、活细胞长期成像、病毒检测等方面展现出广阔的应用前景。
(1)设计开发彩虹色仿生荧光多肽纳米颗粒。
本论文从GFP及其突变体生色基结构获取灵感，系统构建了一系列仿生寡肽，将仿生多肽材料的荧光光谱范围拓展至蓝色、绿色、黄色、橙色和红色等可见光区域，有效地突破了瓶颈限制。由于广泛的分子间作用力和红边激发荧光位移效应(Red edge excitation shift, REES)，非荧光寡肽可自组装形成彩虹色荧光纳米颗粒，被称为多肽彩虹套装(Peptidyl rainbowkit, PRK)，展现出内在的光致发光效应。PRK寡肽在生理条件下具有与荧光蛋白可比拟的生物相容性和光稳定性。相比于GFP，PRK寡肽使用简便、成本低廉，展现出广阔的应用前景。上述特性将促进PRK成为可应用于生物医学领域的仿生荧光材料。
(2)阐释PRK荧光机制-聚集诱导发光。
采用粗粒度分子动力学模拟(Coarse-grained molecular dynamics,CG-MD)、系统的结构表征以及合理的实验等手段对PRK寡肽荧光发光机制进行深度阐释。研究结果表明，丰富的分子间氢键和疏水相互作用是PRK寡肽组装体产生荧光的主要原因。此外，模拟结果直观地阐释了多肽纳米材料的荧光机理，即分子间相互作用力限制了寡肽残基的分子内运动(包括分子内振动、转动等)，从而阻断了能量的非辐射构象弛豫等途径，最终产生聚集诱导发光现象。
(3)荧光多肽纳米颗粒用于实时监测核酸递送过程。
为拓展PRK应用范围，从病毒结构获取灵感，在PRK寡肽结构的基础上设计开发了非致病性多肽病毒样纳米颗粒(Peptidyl virus-like nanoparticles,pVLPs)，即将猿猴空泡病毒核定位序列和人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)第三可变区多肽(Thethird variable loop,V3)等两种具有生物活性的功能性肽段通过二茂铁-苯丙氨酸二肽(Fc-FF)共组装在一起，制备形成具有荧光特性的功能化pVLPs。研究结果表明，pVLPs在绿光光谱范围内表现出稳定的荧光特性，同时具有良好的生物安全性、生物相容性、光稳定性以及细胞穿透性，并在实时监测核酸的递送等应用上展现出优异的性能。
(4)理性设计多肽纳米颗粒用于核酸药物定向递送。
在上述研究的基础上，进一步根据艾滋病病毒表面囊膜蛋白(glycoprotein 120, gp120)上的第三可变区多肽与猿猴空泡病毒大T抗原蛋白分子的核定位序列(Nuclear localization sequence, NLS)，通过分子与纳米仿生，以及对病毒多肽的组装调控，成功制备仿病毒纳米颗粒pVLPs。该颗粒可携带核酸类基因药物，以类似病毒的跨膜方式将基因药物靶向运送至病毒易感细胞内。此外，该仿生病毒颗粒在基因递送过程中还展现出良好的生物相容性、生物活性以及定向运输性。
(5)仿生荧光多肽纳米颗粒用于长期稳定细胞成像。
基于PRK寡肽，成功构建具有聚集诱导发光性质的酪氨酸类(Fc-YY)荧光多肽。与GFP生色基光学性质相似，多肽纳米颗粒中，酪氨酸残基通过分子间氢键交织作用在一起，并在酪氨酸残基变为酚类阴离子时发出绿色荧光。当酪氨酸类多肽与HIV的GPGR多肽序列共价连接后，展现出细胞穿透和溶酶体逃逸等特性。生理条件下，共价连接的酪氨酸类多肽具有良好的光稳定性、pH响应性和生物相容性，在长时间活细胞成像方面具有优异的性能。
(6)仿生章鱼状DNA用于病毒检测。
为进一步拓宽PRK寡肽在生物医学领域的应用，从章鱼捕食过程获取灵感，构建了一种以pVLPs为基因载体的章鱼状DNA(Octopus-like DNA,OLD)，可应用于HIV-1基因的快速无酶检测和HIV感染过程中病毒核酸的可视化。该方法既适用于HIV基因片段的检测，也适用于单链基因组的检测，是一种快速HIV检测技术。该检测方法与设计思路可进一步应用于其他病毒类疾病检测。
综上所述，本论文从水母荧光蛋白发光现象获取灵感，构建多色系多肽荧光纳米颗粒PRK。PRK寡肽及其衍生物在生理条件下展现出良好的生物活性、生物相容性、光稳定性以及pH响应性，在生物分子示踪、基因药物定向递送、活细胞长期成像、病毒检测等方面展现出广阔的应用前景。