肿瘤(tumor)是生物机体在各种生物、理化等各种致瘤因素的作用下,组织中的某单一细胞在遗传学或表观遗传学水平上失去对其生长的正常调控,进而导致单细胞克隆性异常增生而产生的新生物。肿瘤常分为良性和恶性两大类,通常所谓的“癌症”是生物体内所有的恶性肿瘤的统称。近几年,全球恶性肿瘤的发生率及死亡率呈不断上升趋势。据世界卫生组织统计数据显示,2007年,全球新确诊的肿瘤病人超过1200多万人,平均每8个死亡病例中就有1人死于肿瘤,比艾滋病、结核病等导致的死亡总人数还要多。我国内地每年新增肿瘤患者近200万人,死亡约150万人,且发病率以每年超过2%的速度增长。预计到2020年,中国新发病例将分别达到350万,因恶性肿瘤而死亡的人数将达263万。中国卫计委公布的数据显示,无论是在城市或农村,恶性肿瘤已超过了心脑血管疾病,成为中国居民第一大死亡因素,其占总死因的比率已从70年代的12.6%上升至2007年的26.7%。经过全球肿瘤学家多年的不懈努力,学者们发现癌症并非单一疾病,而是数百种疾病的总和。从本质上看,肿瘤归更到底还是一种基因疾病。Tannishtha et al提出肿瘤起源的两种理论模型：克隆演变理论模型和肿瘤干细胞理论模型。克隆演变理论认为,各种内源性遗传和外源性环境的致癌因素以协同或连续作用的方式造成DNA损伤,从而激活原癌基因和(或)灭活肿瘤抑制基因,加上凋亡调控基因和(或)DNA修复基因的异常变化,继而引起染色体的变异和整个基因组的不稳定,使细胞发生转化。发生转化的细胞先呈单克隆性的增生,经过漫长的多阶段的进化过程之后,其中某一个克隆相对无限制的扩增,通过附加的突变,选择性地形成具有不同特征的亚克隆,从而获得转移的能力,并最终形成恶性肿瘤。肿瘤干细胞理论则认为,干细胞在各种内外部因素的作用下发生基因突变,使其不受机体对细胞增值和分化的调控机制所约束而表现出相对的自主性和持续性生长,即形成肿瘤干细胞。在肿瘤组织中只有极其少量的肿瘤干细胞才具有无限增殖和自我更新的能力,并且能够分化成其它类型的细胞并形成恶性肿瘤。目前这两种理论得到很多研究证据支持,因此可能在肿瘤发生发展过程中同时发挥着作用。尽管癌症研究者对肿瘤细胞的起源存在着争论,但是对恶性肿瘤细胞的基本特征却持有一致的观点。Hanahan & Weinberg的文章归纳出癌症的十大基本特征：1.保持增殖信号；2.规避生长抑制信号；3.抗细胞调亡；4.具备无限复制潜能；5.诱导血管新生；6.激活侵袭和转移；7.逃脱免疫摧毁；8.肿瘤诱发炎症；9.细胞能量代谢失调；10.基因组不稳定和突变[1]。前六个特征都是在多步骤的癌症发生过程中获得的,这些特征的存在使得肿瘤细胞能够存活、增值和转移。而后四个特征则可被视为肿瘤细胞获得这些功能的附带特征,它们的存在为肿瘤细胞的产生和生存创造了适宜的条件和环境。肿瘤起源的两种理论模型都基于这样一种假设,即癌症均是由体细胞或干细胞突变而形成的,这些改变主要包括基因扩增、缺失、突变、重排、表观遗传学改变等[2]。遗传学的改变主要包括以下几个方面：1.原癌基因的功能激活(如RAS,C-MYC等)；2.抑癌基因的功能丢失(如RB, TP53等)；3.非编码RNA的表达异常(如miRNA, lncRNA等)；4.维持基因组稳定相关基因的丢失(如ATM, BRCA1等)；。表观遗传学水平上的改变则主要包括以下几个方面：1.DNA的甲基化和去甲基化；2.组蛋白的修饰(甲基化、泛素化、乙酰化等)；3.染色质的改型。这些遗传学和表观遗传学的改变构成了肿瘤发生的分子生物学基础,也成为癌症研究中最受关注的核心问题。近年来随着计算机技术及生物信息学等的飞速发展,测序技术和仪器设备不断取得突破和更新,测序成本也大幅下。高通量、大规模的肿瘤全基因组测序、基因芯片、蛋白质芯片等先进技术越来越多地被肿瘤研究者所使用。Thomas RK等在242例非小细胞肺癌(NSLNC)样本中发现,40%的东亚病人及10%的高加索病人中都出现了EGFR的突变[3]。这些发现连同其它50余种类型的癌症的基因图谱都被收录于国际肿瘤基因组测序项目(International Cancer Genome Consortium, ICGC) 。随着“肿瘤基因组计划”的完成,未来可以通过血液测试就能得出每位病人的癌症基因图谱,这样就能为每位患者量身定制个性化治疗方案,成功实现精准医疗。例如某个肺癌患者体内的EGFR基因发生突变,那么针对这个病人使用“吉非替尼”和“厄罗替尼”两种特异性抑制EGFR的药物,便可取得较好的疗效[4]。近50年的癌症研究取得了长足的进展,研究人员对癌症发生的内在机制和外部特征都有了更为深刻的认识。随着第三代高通量测序技术等新技术的出现和发展,个性化治疗正引起被越来越多的人关注,加之曲妥珠单抗、HPV病毒疫苗等一系列新型药物的研发成功,癌症的治疗效果得到极大提高。尽管如此,癌症仍然是威胁着人类生命健康的最主要疾病之一,癌细胞耐药性出现而引起的复发和转移依然是困扰着我们的两大顽疾。美国癌症研究协会的调查显示,2015年全球有接近890万人死于癌症,接近二分之一的男性和三分之一的女性在有生之年中会罹患癌症；预计到2030年全球可能会有2100万人罹患癌症,并给全球造成美年近4580亿美元的巨大经济损失,因此实现对癌症的彻底治疗依然任重道远[5]。据国际癌症研究机构(IARC)2012年统计数据显示,全球乳腺癌患者超过170万例,死亡病例超过52万。在中国,新发乳腺癌患者占全球新发乳腺癌患者比率的12.2%,乳腺癌死亡病例占全球乳腺癌死亡病例总数的9.6%。由于人的社会经济地位的上升和计划生育政策的实施,中国本地区乳腺癌患者相较于全球乳腺癌患者的比率正逐年上升。乳腺癌作为女性发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,严重的威胁着人类的生命健康,因此乳腺癌己成为我国肿瘤筛查和防止的重点之一。接近30%的患者即便在疾病的早期诊断、早期治疗,最终仍会复发和转移。在诊断时即已发生转移的患者,疾病的发展最初能够通过常规治疗得到有效控制,但随着时间的发展,大多数患者病情最终会进一步恶化。为了提高乳腺癌的诊断率、减少病死率、研发新的诊治措施,需要我们充分掌握乳腺癌发生发展的分子生物学特征。微小RNA(microRNA)是一类长度为19-25个核苷酸的内源性小分子非编码RNA,在众多生物学过程中发挥重要的调节功能,例如胚胎发育、组织器官形成、病毒防御、细胞增殖和肿瘤发生发展等。miRNA可以通过与靶基因mRNA3’-UTR的特定位点结合,遏制其翻译过程或诱导其降解,从而参与基因的表达调控。miRNA可参与肿瘤相关的多种信号通路,与肿瘤的产生、增值、侵袭、转移等过程密切相关。目前,诸多文献报道乳腺癌中多种miRNAs表达异常,例如miR-200、let-7和miR-10b。因此,进一步研究]miRNA在乳腺癌中的表达水平及其功能有利于我们更好的理解乳腺癌发生发展的分子机制,并力求找到能有效防控肿瘤发生发展的新策略。miR-204-5p长度为22 bp,由第9号染色体长臂上TRPM3基因第6内含子编码而来上,其生物学功能研究主要涉及多种肿瘤细胞的生长,增值,迁移,凋亡及调控晶状体和视网膜发育等。大量研究报道证实,miR-204-5p可通过多种关键蛋白抑制肿瘤细胞多方面的生物学功能。Chung TK等证实,miR-204-5p可通过抑制FOXC1基因而起到抑制子宫内膜癌细胞迁移及侵袭[6]。Mikhaylova O等的研究结果显示,在肾透明细胞癌上miR-204-5p是一类VHL调节性肿瘤抑制因子,通过靶向调控MAP1LC3B进而抑制肾透明细胞癌巨自噬[7]。更为重要的是,Hall DP等证实TRPM3和miR-204-5p之间可形成调控环路进而控制肾透明细胞癌肿瘤源性自噬[8]。并且,少量研究报道,miR-204-5p也参与到乳腺癌的发生发展当中。Six1首先在果蝇体内发现,作为Six家族成员之一,发挥着类似于其家族成员所拥有的广泛而又强大的作用。目前为止,Six家族基因已经在从低等无脊椎动物到高等哺乳动物体内均有发现,而其中Sixl是得到关注最多且研究最为广泛的基因,主要涉及到多种组织器官发育,例如肌肉、肾脏、听觉系统、感觉器官和颅面部结构。Sixl主要通过与Eya1/Eya2等蛋白相互作用参与体节生成和眼视觉系统的形成[9,10]。此外,Sixl在肿瘤形成当中的作用也受到极大关注。大量的研究报道证实,Sixl参与多种人类恶性肿瘤的发生,包括乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肝细胞癌、横纹肌肉瘤、肾母细胞癌以及结直肠癌。Sixl通过TGF-P信号通路、Cyclin A1/Cyclin D1、 VEGF-C等关键蛋白参与到乳腺癌的发生发展中[11,12]；通过TRAIL信号通路参与卵巢癌、宫颈癌的形成[13]；通过ZEB1作用于结直肠癌的发生发展[14]。Sixl通过已知的及未知的信号通路参与到多种肿瘤的发生发展当中,广泛影响着多种肿瘤的生物学功能。因此,Sixl的研究对理解肿瘤发生发展机制具有重要意义,同时为肿瘤诊断及治疗提供潜在的的靶点。miR-204-5p功能强大,但是有关乳腺癌的研究报道相对较少,因此有必要对其进一步深入研究。本课题首先利用生物信息学技术,同时使用三种在线生物信息学软件TargetScan, mirDIP及miRDB协同筛查,筛选出miR-204-5p潜在的下游靶基因,并综合挑选评分数较高的100个潜在靶点,剔除已有研究报道证实的靶点,进一步利用双荧光素酶及免疫印迹实验等技术对挑选的的靶基因进行验证。并结合临床标本,利用原位杂交技术检测miR-204-5p在乳腺癌组织中的表达水平,同时通过免疫组化实验技术检测相应靶基因在相同乳腺癌组织中的表达水平。其次通过体外细胞功能实验来研究miR-204-5p对乳腺癌细胞增值、迁移及侵袭等多种生物学行为的影响。由于Six1具有转录因子功能,本实验进一步通过实时荧光定量PCR检测其可能对miR-204-5p及相关基因表达水平的影响,以期阐明其在乳腺癌中发挥作用的分子机制。本课题的研究成果将进一步加深我们对乳腺癌发生发展机制的了解,为乳腺癌的早期诊断及治疗提供新的策略,或可以为此疾病的新药研发提供关键的分子靶点。研究方法1.miR-204-5p下游靶基因的预测及对靶基因Six1调节作用的研究通过miRNA靶基因预测网站包括TargetScan、mirDIP、 miRBase对miR-204-5p可能的作用靶点进行预测。2.以MCF-7细胞总RNA为模板,扩增基因Sixl mRNA 3’-UTR序列,连接psiCHECKTM-2载体,构建psiCHECKTM--Sixl-3-UTR野生型荧光素酶重组质粒。3.以psiCHECKTM-2-Sixl-3’-UTR重组质粒为模板,进行亚克隆。采用SOE的方法,扩增Six1-3’-UTR突变型重组质粒,包括psiCHECKTM-2-Six1-3’-UTR-Mut-1+Mut-2、psiCHECKTM-2-Sixl-3’-TR-Mut-1、 psiCHECKTM-2-Sixl-3’-UTR-Mut-2.4.采用双荧光素酶报告基因检测系统对靶基因的确认。设计miR-204-5p mimic组、mimic NC组进行实验,分别转染293T、MCF-7、 MDA-MB-231细胞,48h后收集各组荧光信号,实验采用One-Way ANOVA统计方法进行分析。2. miR-204-5p及Sixl在乳腺癌中的表达及意义收集30例乳腺癌新鲜临床标本,分别采用原位杂交技术(in situ hybridization, ISH)和免疫组织化学技术(immunohistochemistry, IHC)检测miR-204-5p和Six1在相同连续乳腺癌组织切片中的表达水平,并分析两者表达关联性及独立临床意义。3.miR-204-5p对乳腺癌细胞生物学功能的影响(1)实验分为两组：MCF-7-NC细胞组(阴性对照)、MCF-7-miR-204细胞组(实验组)。(2)MTT实验检测并绘制0h、12h、24h及48h出各组细胞生长增殖曲线,评估miR-204-5p对于MCF-7、MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖能力的影响。(3)划痕实验检测MCF-7各组细胞迁移能力,评估过表达miR-204-5p对MCF-7细胞迁移能力的影响。(4) Matrigel-Transwell实验检测并获取各组乳腺癌细胞侵袭实验图,评价miR-204-5p对MCF-7、 MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响。4. Sixl/miR-204-5p反馈调节分子机制的研究(1)以MCF-7细胞总RNA为模板,扩增基因Sixl mRNA CDs序列并构建pcDNA-3.1-Sixl重组质粒。(2)分别用NC、Sixl-siRNAl, Six1-siRNA2、 pcDNA3.0-Sixl转染MCF-7细胞,采用实时荧光定量PCR技术检测转染后各组miR-204-5p的表达量,并分析其意义。(3)并且分别用mimics NC、 miR-204-5p mimics、 siRNA1、 siRNA2、Sixl+siRNAl、 Sixl+siRNA2转染MCF-7细胞株,免疫印迹实验检测Six1及侵袭相关CDH1(E-cadherin)蛋白表达水平。研究结果1.miR-204-5p下游靶基因的预测结果及对靶基因Six1调节作用的研究结果(1)生物信息学分析：三种在线数据库TargetScan、 miRDIP、 miRBase预测并筛选出miR-204-5p的靶基因Six1；分析结果显示,miR-204-5p与Sixl 3’-UTR存在两个7bp互补配对位点。(2)双荧光素酶报告基因结果证实了miR-204-5p可与Sixl 3’-UTR结合。(3)免疫印迹实验检测到miR-204-5p下调Six1蛋白的表达水平。(4) Western blot检测到不含3’-UTR的外源性Sixl CDs序列重组基因不受miR-204-5p的调控,并且miR-204-5p对Six1的抑制作用可通过引入外源性Six1而逆转。2. miR-204-5p及Six1在乳腺癌中的表达呈负相关在miR-204-5p高表达的乳腺癌组织标本当中,Six1呈现出低表达；而在miR-204-5p低表达的乳腺癌组织标本当中,Six1呈现出高表达。miR-204-5p及Six1在乳腺癌组织中的表达水平呈现出明显的负相关。3. miR-204-5p通过靶向调控Six1抑制乳腺癌细胞迁移及侵袭,但并不影响其增值能力。(1) miR-204-5p mimic成功转染MCF-7细胞后,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测MCF-7细胞miR-204-5p的表达明显升高。miR NC成功转染至MCF-7细胞,转染后阴性对照组与实验组相比,MCF-7细胞中miR-204-5p的表达明显降低。(2)MTT法检结果,MCF-7-miR204组与阴性对照mimic NC相比,采用独立样本t检验分析转染miR-204-5p mimic对细胞增殖的影响,24h T=0.636,P=0.543；48h T=0.842,P=0.424；72h T=1.716,P=0.125；P值均>0.05。实验结果表明miR-204-5p表达水平改变可能对MCF-7细胞的增殖无影响,miR-205-5p并非乳腺癌细胞增殖相关基因。(3)划痕实验结果显示,经过24h无血清培养后,与miR-204-5p mimic组相比,转染阴性对照组的划痕距离明显减少,实验组可见明显划痕。实验结果表明miR-204-5p过表达可促进MCF-7细胞迁移。(4) Matrigel-Transwell实验结果显示,MCF-7细胞miR-204-5p mimics转染组的迁移能力明显弱于mimics NC组,MDA-MB-231细胞miR-204-5p mimics转染组的迁移能力也明显弱于mimics NC组,实验结果通过独立样本t检验,T=15.469,P=0.000,结果差异具有统计学意义。体外实验表明,外源性过表达miR-204-5p不能影响乳腺癌细胞的增值能力,但是外源性过表达miR-204-5p可明显抑制乳腺癌细胞的迁移及侵袭能力,miR-204-5p可作为肿瘤抑制基因。4. Sixl/miR-204-5p形成负反馈调控环路(1) Sixl siRNA组miR-204-5p表达量明显高于NC组及Sixl过表达组,表明Six1可抑制miR-204-5p基因的表达。(2) miR-204-5p过表达组相比较mimic NC组的Six1蛋白表达量明显降低,内源性miR-204-5p与Six1在乳腺癌中表达呈显著负相关。可见,Six1在乳腺癌中可抑制miR-204-5p表达。并且miR-204-5p通过抑制Six1的表达,进而上调CDH1的表达量,从而抑制乳腺癌细胞迁移及侵袭。因此,miR-204-5p和Six1间形成双向负反馈环路。