丹参是重要的药用植物模式材料,也是需求较大的中药材,其丹酚酸和丹参酮类等次生代谢产物有效成分具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗菌消炎、降血脂等多种药用活性并被广泛应用于预防和治疗高血脂、心脑血管和急性缺血性中风等疾病。随着心脑血管疾病发病率升高及日常保健意识的增强,丹参需求量逐年快速增加,野生丹参资源日渐枯竭,而栽培丹参供应及品质难以满足,且通过化学合成制备丹参次生代谢产物可行性较低。因此,基于基因工程策略改善丹参品质、提高有效成分含量日益引起研究者的关注。本文针对丹参基因工程有效实施的关键环节展开工作,首先构建基于Bsata除草剂抗性的叶盘稳定转化再生体系及基于rolABC因子的毛状根诱导培养体系,在此基础上,通过转录因子AtEDT1过表达、丹酚酸合成代谢旁路基因SmHPPD和SmCCR抑制表达及多胺代谢调控基因SmSAMDC过表达的策略,分析丹参酮、丹酚酸等丹参主要次生代谢成分积累规律,为有效应用基因工程策略改善丹参品质、有效满足供给提供研究思路、调控节点、关键原件及基础材料。主要研究内容及结果如下:1.建立了Basta除草剂为选择标记的丹参遗传转化再生体系:首先通过梯度设置Basta浓度,最终确定0.6 mg/L的Basta浓度作为最适丹参选择压;进而构建35S启动子驱动Basta抗性基因的T-DNA骨架载体,并优化预培养、共培养、筛选培养、诱导再生等培养环节参数,实现了基于Basta除草剂选择的丹参农杆菌介导的有效转化再生;经过T-DNA目标PCR扩增及GUS组织化学染色,确认了转化子的有效性,为二次转化创制双抗材料提供了基础材料。2.针对发根质粒诱导毛状根再生的关键基因簇rolABC,构建rolA、rolB、rolC单基因及rolABC多基因丹参毛状根诱导体系,以避免农杆菌Ri质粒T-DNA区域冗余基因对植物毛状根次生代谢系统的干扰,最大限度有效应用毛状根系统进行丹参次生代谢工程研究。3.构建基于Basta除草剂抗性选择的拟南芥转录因子AtEDT1(Arabidopsis thaliana Enhanced Drought Tolerance1)过表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化,创制AtEDT1过表达丹参转化材料。栽培实验表明,丹参AtEDT1转化株系表现了明显的生长优势,特别是在逆境胁迫条件下,生长量显著优于对照材料。进一步研究显示,丹参AtEDT1转化材料中,转AtEDT1丹参根系中,丹酚酸合成代谢相关基因(SmTAT、SmHPPR、SmPAL、SmC4H、Sm4CL和SmRAS)的表达水平明显提升。与其对应,转基因材料根系中丹酚酸类化合物(迷迭香酸、紫草酸及丹酚酸B)的合成积累也相应增加,转基因株系SmTAT基因的表达水平高达野生型丹参的6倍,丹酚酸B的含量增加至61.9mg/g约为野生型丹参的1.55倍。同时,过表达AtEDT1也对丹参酮合成途径调控基因(SmHMGR、SmMDS和SmIPPI)表达水平表现为多样调控效果,转基因株系中丹参酮类化合物(隐丹参酮、二氢丹参酮I和丹参酮IIA)的合成积累也呈现不同积累水平。4.基于丹参毛状根诱导体系,验证了MIGS(miRNA-induced gene silencing)技术在丹参基因功能研究中的有效性。进而针对丹参酚酸合成旁路基因SmHPPD和SmCCR构建单基因及多基因MIGS抑制表达载体,基于丹参毛状根转化体系,实现了目标基因的有效沉默。相对于对照材料,SmHPPD和SmCCR抑制表达毛状根形态及生长没有明显差异,但丹酚酸类化合物积累水平(特别是迷迭香酸)显著提高。5.针对丹参多胺合成代谢关键基因SmSAMDC,分析了其组织特异性表达模式,进而构建了基于Basta除草剂选择的过表达载体,经农杆菌介导的遗传转化,创制丹参SmSAMDC过表达新材料,尝试通过调控多胺生成进行丹参次生代谢产物调控。转基因分子、表型鉴定表明,受体丹参转化材料明确整合有包含SmSAMDC表达单元的T-DNA,但没有明显的目标性状体现。考虑到同源转化中普遍存在的转基因沉默现象,我们以烟草为转化受体材料进行SmSAMDC异源表达分析,发现烟草SmSAMDC异源表达材料在干旱胁迫条件下,通过SmSAMDC异源表达可显著提升受体植物材料相对含水量及抗氧化活性,为SmSAMDC在丹参代谢工程中有效应用提供了基础数据。基于以上研究工作,本研究有效拓展了丹参遗传转化平台,实现了基于转录因子AtEDT1过表达及丹酚酸合成代谢旁路基因SmHPPD、SmCCR抑制表达策略的丹参次生代谢产物调控,并对丹参多胺代谢调控基因SmSAMDC的表达特性及功能进行了研究。本文的研究工作为丹参基因工程的有效应用提供了可行转化平台、目标调控位点及实施案例,为有效实现丹参质量提升及产量供应提出了新的解决方案。