革兰氏阴性菌在水产动物病原菌中种类最多,是水产动物主要致病性病原菌。N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones,AHLs),是革兰氏阴性菌致病性应答系统中的关键信号分子。当菌群中AHLs累计到一定浓度后,能激活病原菌致病基因的表达,导致病害的发生。N-酰基高丝氨酸内酯酶是一类特异性降解AHLs的金属蛋白水解酶,存在广泛,在多种微生物中均有发现。近年来,N-酰基高丝氨酸内酯酶作为群体感应淬灭策略的工具酶成为研究的热点。本研究的目的是通过对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis T-1)中的N-酰胺内酯酶基因ytn P进行克隆表达,研究其作用与功能,从群体感应抑制角度,探索水产细菌性病害的新的路径,为水产业的健康可持续发展提供技术保障。1.ytn P基因的全长克隆及生物学分析本研究自地衣芽孢杆菌T-1全基因组测序得到ytn P基因的全长序列,通过PCR扩增目的基因ytn P,连接克隆载体pGEM-T Easy Vector,筛选阳性克隆并进一步测序鉴定,得到ytnP的全长900 bp序列;通过对ytn P的生物信息学分析发现,ytn P编码区770 bp,编码256个氨基酸,分子量为29 kD,等电点为5.62;含有S磷酸化位点和金属β内酰胺酶家族保守结构域H-H-DH--,--GH-H--;根据疏水性分析和跨膜信号肽预测,YtnP为酸性亲水蛋白,不具有跨膜信号区;通过蛋白质二维和三维结构预测,YtnP蛋白含有α-螺旋、β-折叠和不规则卷曲结构分别占比37.11%,22.27%和40.62%,预测的YtnP的三维结构和已报道的N-酰基高丝氨酸内酯酶同源性达98%,并含有同家族的活性中心。2.ytnP基因的原核表达与纯化复性本研究首先成功构建重组质粒pEASY-Blunt E1-ytnP,并转入大肠杆菌,获得BL21(DE3)-pEASY-Blunt E1-ytnP程菌;再通过IPTG(异丙基硫代半乳糖苷,Isopropylβ-D-Thiogalactoside)诱导工程菌,成功表达ytnP。并优化表达条件,得到ytnP基因在0.2 mM的IPTG,37℃诱导8 h,蛋白的表达量最高。利用镍离子与组氨酸标签的螯合法纯化YtnP蛋白,通过优化得到洗脱条件为咪唑浓度为150 mM,填料体积为3 mL和流速为30 mL/h时,蛋白质纯化为最佳,蛋白浓度达到2.17μg/μL。通过透析和谷胱甘肽氧化还原系统相结合的方法,复性包涵体YtnP蛋白,具有活性的蛋白浓度为0.81μg/μL,复性率达36.8%。以紫色杆菌野生型(Chromobacterium Violaceum ATCC 12472)和突变型(C.Violaceum CV026)为报告菌株,通过“H”划线法和牛津杯法分别成功验证了所构建的工程菌和复性蛋白的群体感应淬灭作用。并以C6-HSL信号分子为底物,测定该具有群体感应抑制作用的YtnP蛋白的酶活为1.97 U/mL。3.YtnP对嗜水气单胞菌生物膜的作用研究表明,嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)生物膜的形成受QS的调控。本实验研究中,通过测定不同接种量对嗜水气单胞菌生物膜形成的影响,得到接种量为10~7 CFU/mL时为最佳浓度;通过加入YtnP至嗜水气单胞菌共培养时,和未加YtnP对照组比较发现,当YtnP浓度为80 ng/μL时对嗜水气单胞菌生物膜的抑制率为68%,YtnP浓度为20 ng/μL时对其生物膜的抑制率仍高于50%(p<0.05)。实验进一步研究了YtnP和抗生素联用对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度(Minimal Inhibit Concentration,MIC)的影响。实验结果显示,当YtnP分别与甲砜霉素和盐酸多西环素联合使用时,对嗜水气单胞菌的MIC值分别由4μg/mL、0.5μg/mL降至1μg/mL、0.125μg/mL,敏感程度显著升高。4.Ytnp对嗜水气单胞菌毒力因子表达的影响嗜水气单胞菌中存在以AHLs为信号分子的QS系统,调控嗜水气单胞菌的毒力因子的表达。本实验利用荧光定量PCR,定量检测了群体感应抑制蛋白YtnP对细胞肠毒素基因ast、溶血素基因hem、肠毒素基因aerA、弹性蛋白酶基因ahyB、胞外蛋白酶基因ep表达的影响。实验结果表明,细胞肠毒素基因ast在24-36 h内和对照组相比基因表达量下调显著,分别下调了20倍,15倍和7倍(p<0.05);溶血素基因hem表达量在8-12 h和30-36 h下调非常显著,均下调5-20倍(p<0.01);aerA肠毒素基因表达量在4-8 h,20-24 h以及36-60 h下调非常显著,最高下调80倍(p<0.01);胞外蛋白酶基因ep表达量,在12-20 h和24-48 h下调非常显著(p<0.01)。且加入YtnP后在4-12 h内使得嗜水气单胞菌无溶血性。通过嗜水气单胞菌对异育银鲫(Carassius auratus gibelio)攻毒实验显示,重组酶YtnP是安全无毒的,且加入YtnP后异育银鲫的96 h内累计死亡率由78%降低至27%(p<0.05)。本研究首次从地衣芽孢杆菌中克隆表达群体感应抑制基因ytnP,得到具有抑制活性的蛋白,并用于嗜水气单胞菌的生物防治研究。YtnP可显著降低嗜水气单胞菌的生物膜的形成,并抑制其毒力因子的表达,从而降低致病性嗜水气单胞菌对宿主的侵染和毒害。该研究为将群体感应抑制蛋白应用于对于致病性嗜水气单胞菌的生物防治奠定了理论基础。