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目的： 百草枯(paraquat,PQ)中毒所致急性肺损伤（acute lung injury, ALI）是PQ中毒死亡的主要原因，主要表现为急性肺泡炎和肺间质纤维化。由于中毒机制目前尚未阐明，而且没有特效的治疗手段，绝大多数病例死亡。因此，研究PQ中毒机制及其治疗手段，具有非常重要的科学意义和社会应用前景。 一些动物实验的研究结果得到的公认结论是氧化应激和炎症反应起着重要的作用。由于Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）位于炎症信号转导的最上游环节，因而被认为是进行炎症反应调控治疗的潜在理想靶点。TLRs近年来在机体对外来病原体的识别和启动天然防御系统方面的研究有很重要的进展，在调节ALI后的炎症和修复机制方面扮演着重要的角色，而越来越多的证据表明TLRs在非感染性肺疾病中也扮演重要的角色。在动物模型中，大量的数据说明，TLR2和4对于非感染性刺激而促发炎症反应。 Toll作用蛋白(Toll-interacting protein，Tollip)是新近发现的一种接头蛋白，是TLRs/IL-1R信号转导通路中的一个重要的负性调控因子，而该通路与炎症的发生和发展密切相关，它可以抑制IRAK的磷酸化，从而阻止下游信号转导，减少NF-κB的转录活性，在炎症反应的负调控中发挥重要作用。大量研究结果已证实Tollip过表达可以抑制TLR2和TLR4的信号转导通路，限制促炎介质的生成，从而起到抑制炎症反应的作用。因此，上调Tollip表达在治疗急性炎症性疾病中可能是一种有效的治疗策略。 本研究拟通过构建携带小鼠源性Tollip基因重组腺病毒载体上调Tollip的表达。通过观察A549细胞在基因表达、氧化应激和炎症反应等方面的变化，研究Tollip过表达对百草枯诱导的A549细胞功能的影响;并在动物水平上，确定Tollip对PQ中毒所致小鼠ALI的保护作用，为PQ所致ALI的防治提供新的作用靶点。 实验方法： 1、小鼠Tollip基因重组腺病毒载体的表达与验证 通过Ad.mTollip感染A549细胞和小鼠肺组织，建立Ad.mTollip体内外的感染模型，利用Western-blot、免疫组化和肺组织切片HE染色的方法，对Ad.mTollip在真核细胞与肺内的表达效力及对宿主肺部病理改变的影响进行检测。 2、Tollip过表达对百草枯诱导的A549细胞功能的影响及机制研究 通过CCK-8法检测细胞存活率筛选出PQ浓度及作用时间，以MOI=100分别加入Ad.mTollip或Ad.V感染A549细胞，48h后以PQ600μmol/L处理细胞，作用时间点为24h，分四组:control组、PQ组、PQ+Ad.V组、PQ+Ad.mTollip组。用免疫细胞化学染色、RT-PCR和Western-blot的方法观察TLR2、TLR4和Tollip在A549细胞中的表达情况;用流式细胞仪检测细胞内活性氧含量;检测超氧化物歧化酶的活性和丙二醛的含量;用EMSA检测A549细胞中NF-κB核转录水平的变化;用ELISA检测细胞上清液IL-1β水平变化。 3、Tollip过表达对百草枯中毒所致小鼠急性肺损伤的保护作用 选择清洁级C57BL/6J小鼠42只，8-12周龄，体重20-25 g，雌雄不限，随机分为七组:control、PQ24h组、PQ72h组、PQ+Ad.V24h组、PQ+Ad.V72h组、PQ+Ad.mTollip24h组、PQ+Ad.mTollip72h组，每组6只小鼠。用气管内滴注的方法，以5×108PFU/只的剂量建立小鼠Ad.mTollip感染模型，同时空病毒载体Ad.V作为对照。感染48h后，腹腔注射PQ28 mg/kg建立急性肺损伤模型。在PQ染毒后24h、72h，用免疫组织化学染色、RT-PCR和Western-blot的方法观察Tollip在小鼠肺内的表达情况;HE染色观察小鼠肺组织病理学变化并进行病理学评分;检测髓过氧化物酶的活力;用EMSA检测肺内NF-κB核转录水平的变化;用ELISA检测血清和肺组织匀浆中IL-1β水平变化。 实验结果： 1、通过Western-blot和免疫组化方法分别检测到重组腺病毒Ad.mTollip可以有效地在A549细胞内和小鼠肺内稳定表达;且经气管内滴注感染宿主后，不会引起宿主肺组织发生病理变化。 2、通过CCK-8法确定PQ600μmol/L作用24h作为实验的干预点;通过免疫细胞化学、Real-time PCR和Western-blot方法观察在PQ诱导后，TLR2和TLR4在mRNA水平和蛋白水平都有显著升高(P＜0.05)，而Tollip在mRNA水平和蛋白水平都有所下降，转染Ad.mTollip后，TLR2和4表达明显下调(P＜0.05)，而Tollip的表达明显上调(P＜0.05);与PQ组和PQ+Ad.V组相比，PQ+Ad.mTollip组ROS水平和MDA含量均明显降低，而SOD水平均明显升高(P＜0.05);细胞内NF-κB活性明显降低，炎症因子IL-1β的生成随之明显降低(P＜0.05)。 3、免疫组化、RT-PCR以及Western-blot的方法观察Tollip在PQ组和PQ+Ad.V组表达减弱，表达强度低于正常对照组，而与PQ组和PQ+Ad.V组相比，PQ+Ad.mTollip组的Tollip表达强度明显增强(P＜0.05);转染Ad.mTollip后，与PQ组和PQ+Ad.V组相比，PQ+Ad.mTollip组小鼠肺组织的损伤减轻、肺内MPO和NF-κB的活性降低、血清和肺组织匀浆中炎症介质IL-1β的含量减少。 结论： 1、重组腺病毒Ad.mTollip可以有效地在A549细胞内和小鼠肺内稳定表达，同时对于宿主而言也是安全可行的。 2、TLR2和TLR4可能参与了PQ导致A549细胞内氧化应激和炎症反应。 3、转染Ad.mTollip后，Tollip过表达，细胞内ROS水平和MDA含量均明显降低，而SOD水平明显升高，抑制PQ导致A549细胞内氧化应激反应的发生。 4、PQ导致的炎症反应可能是通过TLR2/TLR4—NF-κB—炎症介质这一信号转导通路实现的。转染Ad.mTollip后，Tollip过表达，细胞内NF-κB活性明显降低，抑制PQ导致A549细胞内炎症反应的发生。 5、增强肺内Tollip的表达可以通过抑制NF-κB的活性，减轻PQ诱导的急性肺损伤小鼠的炎症反应及肺部病理损伤，对百草枯所致的急性肺损伤小鼠有保护作用。