大豆是重要的食物过敏原之一,与牛乳、鸡蛋一起被称为儿童的三大“过敏原”,严重影响了儿童的健康成长。β-伴大豆球蛋白作为主要的大豆过敏蛋白,其中的α亚基即Gly m Bd 60K是易感人群的重要过敏原,也是最早被公认的主要过敏原蛋白。加工处理可以有效降低β-伴大豆球蛋白的抗原性,因此定位加工导致Gly m Bd 60K抗原性降低的表位区域,对于探明加工降低Gly m Bd 60K致敏性的分子机制,正确指导安全食品的生产,防止食物过敏性疾病的发生有重大意义。本文利用等电点沉淀、硫酸铵分级盐析和凝胶过滤得到纯度较高的β-伴大豆球蛋白,Western-Blot鉴定结果表明:纯化的β-伴大豆球蛋白可以与兔抗血清反应,具有免疫活性。单因素试验基础上,以响应面法优化β-伴大豆球蛋白超高静压处理条件,得到β-伴大豆球蛋白超高静压处理的最佳条件为:超高静压处理压强455 MPa、处理时间18 min、β-伴大豆球蛋白质量浓度15 mg/m L,此时抗原抑制率为49.59%。对超高静压处理前后β-伴大豆球蛋白的结构研究发现:超高静压处理不改变蛋白质的分子量;经超高静压处理后β-伴大豆球蛋白的游离巯基含量、表面疏水性显著增加,且随着压强及时间的增大呈现先增加后减少的趋势,400 MPa,15 min后游离巯基含量和表面疏水性减少;超高静压处理后β-伴大豆球蛋白的无序结构和β转角含量增加。试验确定热加工处理条件为蛋白浓度10 mg/m L,100℃加热60 min,此时抗原抑制率为38.4%;糖基化处理选择大豆分离蛋白（SPI）-葡萄糖复合物,糖质比3:1,反应温度60℃,反应时间2.5 d,此时抗原抑制率为42.8%。利用生物信息学方法,预测出Gly m Bd 60K的六个主要构象表位区段²³⁹NQRSPQ LQN²⁴⁷,³¹⁷DNNE³²⁰,³⁷⁹EEGQQQGEQ³⁸⁷,⁴¹³SRK⁴¹⁵,⁴¹⁸SSED⁴²¹,⁴⁹⁷EQQQEEQQEEQ⁵⁰⁷。根据预测结果对Gly m Bd 60K基因进行重叠（overlapping）分段,设计合成引物,通过PCR扩增Gly m Bd 60K全长及其overlapping片段,并连接到T7噬菌体上。包装后,得到Gly m Bd 60K及其overlapping重组噬菌体,鉴定后将阳性噬菌体进行扩大培养及纯化,得到A、B、C、D四段噬菌体纯化蛋白,免疫印迹结果表明,分段表达蛋白可以与兔抗血清反应,具有免疫活性。将噬菌体表达纯化后的蛋白与加工破坏抗原表位特异性抗体反应定位得到加工破坏抗原表位主要位于C段,对其进行进一步的overlapping分段,经PCR扩增后与T7噬菌体载体相连。然后在T7噬菌体表面表达,测定其与加工破坏抗原表位特异性抗体的结合情况,开展第二轮的筛选与鉴定,经过3轮的分段表达和筛选,确定加工破坏抗原区域为C2-1和C2-2片段。同时发现噬菌体表达蛋白可以与大豆过敏患者血清反应,具有致敏性。对筛选得到的抗原区域进行二级结构预测,C2-1片段前面部分的结构是无规则卷曲,后面部分的主要结构是α-螺旋,C2-2片段的主要结构为无规则卷曲。利用重叠多肽技术对筛选得到的片段进行研究,发现C2-1片段上一段线性抗原表位³⁸⁰EGQQQGEQRLQESVIVE³⁹⁶,也是致敏表位。而且,合成的重叠多肽不与加工破坏抗原表位特异性抗体反应,说明加工处理不改变蛋白质的一级结构。对得到的阳性肽片段进行定点突变,确定关键氨基酸位点为Q382,Q383,G385,Q387。