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实验目的：
视神经轴突损伤后难以再生仍然是临床上面临的关键问题。作为一种中枢神经，视神经轴突损伤后难以再生有着复杂的分子生物学机制。除了中枢神经元本身再生能力有限外，轴突损伤切断了生长因子沿轴突从脑靶区向视网膜神经节细胞（RGCs）运输，损害了RGCs的正常生理功能，并进一步促进RGCs凋亡，限制了轴突再生的潜力。因此运用材料学的方法，在损伤部位植入具有生长因子缓释功能的药物载体，弥补因轴突损伤导致的RGCs中神经生长因子（NGF）匮乏，可望为RGCs轴突再生提供适合的微环境。与传统给药方式相比，人工合成的生物材料将神经营养因子局部且持续地输送到视神经损伤部位，既可以保护药物活性又可实现药物的可控释放。水凝胶具有与生物组织相近的力学性质和较好的生物相容性，广泛用于植入型生物医用材料的研究。本课题旨在构建一种梯度负载CNTF的视神经再生微柱，并对其性能进行评价。
实验方法：
首先应用热共沉淀方法，制备含铁磁性纳米粒（MNP），利用聚乙二醇-聚谷氨酸（PEG-PGA）表面功能化修饰得到PEG-MNP，使其具有较好溶剂分散性和稳定性。应用油包水（W/O）的方法，将含有磁性纳米粒的明胶溶液在水相微泡中交联，形成磁性明胶微球（GMP@PEG-MNP）。并进一步利用直接接触法，将GMP@PEG-MNP与高浓度重组人睫状节神经营养因子（CNTF）共混，CNTF通过自由扩散包载进GMP@PEG-MNP，获得共包载CNTF和MNP的明胶微球（CNTF-GMP@PEG-MNP）。将CNTF-GMP@PEG-MNP与甲基丙烯酸酯化明胶（Gel-Ma）溶液在石英模具中混合，利用外界磁场形成CNTF梯度，接着通过光固化获得梯度负载CNTF的微柱。借助傅里叶红外光谱（FTIR）、动态光散射系统（DLS）、X光电子能谱（XPS）、透射电子显微镜（TEM）、EDX-Mapping、热重分析（TGA）等手段对材料理化性质进行表征；通过荧光显微镜观察微柱内载药微球的梯度分布效果；借助CCK-8法、视网膜外植体培养法评价材料的生物相容性及其轴突定向再生的效果；利用大耳白兔视神经损伤模型，采用CTB逆向示踪法，考察微柱诱导轴突再生的能力。
实验结果：
首先，DLS结果显示经PEG-PGA修饰后，磁性纳米粒在水中的分散性和稳定性得到了明显的改善。透射电镜和元素分布分析结果表明，PEG-MNP已经成功包载进明胶微球（GMP）中。磁性纳米粒的粒径分布在100-200nm之间，明胶微球的粒径约为29.94±6.9μm。通过改变磁纳米粒子与明胶的投料比，可以调节GMP@PEG-MNP内部PEG-MNP的含量，即其磁性大小。明胶经京尼平交联成微球后，可自发产生红色荧光。将磁性明胶微球悬液与Gel-Ma溶液在石英模具中共混，外源磁场作用下，制备得到明胶微球梯度分布的Gel-Ma微柱。利用BSA-FITC作为模型蛋白药物，进一步将BSA-FITC包载进GMP@PEG-MNP，制备BSA-FITC梯度分布的微柱，对样本进行冰冻切片，观察不同位置处微柱切片BSA-FITC的释放浓度，进一步说明形成了药物梯度分布的载药微柱。CCK-8的结果说明微球和微柱的生物相容性良好。在体外，具有CNTF药物梯度的Gel-Ma膜片可定向诱导视网膜轴突的生长。将Gel-Ma微柱植入大耳白兔视神经损伤缺损处，初步观察表明，这种CNTF梯度分布的微柱能够诱导受损轴突再生。
实验结论：
本研究利用外源磁场诱导法，成功制备了具有CNTF梯度的载药微柱，在体外，具有CNTF药物梯度的Gel-Ma膜片可以定向诱导视网膜轴突沿药物浓度梯度生长。在大耳白兔视神经损伤模型中，Gel-Ma微柱能够诱导视神经轴突再生。
视神经轴突损伤后难以再生仍然是临床上面临的关键问题。作为一种中枢神经，视神经轴突损伤后难以再生有着复杂的分子生物学机制。除了中枢神经元本身再生能力有限外，轴突损伤切断了生长因子沿轴突从脑靶区向视网膜神经节细胞（RGCs）运输，损害了RGCs的正常生理功能，并进一步促进RGCs凋亡，限制了轴突再生的潜力。因此运用材料学的方法，在损伤部位植入具有生长因子缓释功能的药物载体，弥补因轴突损伤导致的RGCs中神经生长因子（NGF）匮乏，可望为RGCs轴突再生提供适合的微环境。与传统给药方式相比，人工合成的生物材料将神经营养因子局部且持续地输送到视神经损伤部位，既可以保护药物活性又可实现药物的可控释放。水凝胶具有与生物组织相近的力学性质和较好的生物相容性，广泛用于植入型生物医用材料的研究。本课题旨在构建一种梯度负载CNTF的视神经再生微柱，并对其性能进行评价。
实验方法：
首先应用热共沉淀方法，制备含铁磁性纳米粒（MNP），利用聚乙二醇-聚谷氨酸（PEG-PGA）表面功能化修饰得到PEG-MNP，使其具有较好溶剂分散性和稳定性。应用油包水（W/O）的方法，将含有磁性纳米粒的明胶溶液在水相微泡中交联，形成磁性明胶微球（GMP@PEG-MNP）。并进一步利用直接接触法，将GMP@PEG-MNP与高浓度重组人睫状节神经营养因子（CNTF）共混，CNTF通过自由扩散包载进GMP@PEG-MNP，获得共包载CNTF和MNP的明胶微球（CNTF-GMP@PEG-MNP）。将CNTF-GMP@PEG-MNP与甲基丙烯酸酯化明胶（Gel-Ma）溶液在石英模具中混合，利用外界磁场形成CNTF梯度，接着通过光固化获得梯度负载CNTF的微柱。借助傅里叶红外光谱（FTIR）、动态光散射系统（DLS）、X光电子能谱（XPS）、透射电子显微镜（TEM）、EDX-Mapping、热重分析（TGA）等手段对材料理化性质进行表征；通过荧光显微镜观察微柱内载药微球的梯度分布效果；借助CCK-8法、视网膜外植体培养法评价材料的生物相容性及其轴突定向再生的效果；利用大耳白兔视神经损伤模型，采用CTB逆向示踪法，考察微柱诱导轴突再生的能力。
实验结果：
首先，DLS结果显示经PEG-PGA修饰后，磁性纳米粒在水中的分散性和稳定性得到了明显的改善。透射电镜和元素分布分析结果表明，PEG-MNP已经成功包载进明胶微球（GMP）中。磁性纳米粒的粒径分布在100-200nm之间，明胶微球的粒径约为29.94±6.9μm。通过改变磁纳米粒子与明胶的投料比，可以调节GMP@PEG-MNP内部PEG-MNP的含量，即其磁性大小。明胶经京尼平交联成微球后，可自发产生红色荧光。将磁性明胶微球悬液与Gel-Ma溶液在石英模具中共混，外源磁场作用下，制备得到明胶微球梯度分布的Gel-Ma微柱。利用BSA-FITC作为模型蛋白药物，进一步将BSA-FITC包载进GMP@PEG-MNP，制备BSA-FITC梯度分布的微柱，对样本进行冰冻切片，观察不同位置处微柱切片BSA-FITC的释放浓度，进一步说明形成了药物梯度分布的载药微柱。CCK-8的结果说明微球和微柱的生物相容性良好。在体外，具有CNTF药物梯度的Gel-Ma膜片可定向诱导视网膜轴突的生长。将Gel-Ma微柱植入大耳白兔视神经损伤缺损处，初步观察表明，这种CNTF梯度分布的微柱能够诱导受损轴突再生。
实验结论：
本研究利用外源磁场诱导法，成功制备了具有CNTF梯度的载药微柱，在体外，具有CNTF药物梯度的Gel-Ma膜片可以定向诱导视网膜轴突沿药物浓度梯度生长。在大耳白兔视神经损伤模型中，Gel-Ma微柱能够诱导视神经轴突再生。