溶藻微生物的分离及其分子生物学研究

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蓝藻水华在富营养化的湖泊和水库中频频爆发,给环境和人类健康带来巨大灾难。近年来,在全球范围内,尤其是在发展中国家更为频繁爆发。但是,迄今为止却没有有效可行的治理方法。因此,为了探讨生物控藻的新途径,本文对水华污水中分离的溶藻生物因子进行了较系统的分子生物学研究。 本文采用一种特殊的培养基(SM培养基)从滇池(高度富营养化的高原湖泊)中分离到一株螺旋丝状的溶藻细菌,命名为PdY3。根据它的形态学特征、生物学特性和16SrDNA序列,将其鉴定为一株新的腐败螺旋菌。 PdY3的形态特征与溶藻特性的相关性分析结果显示,在固体培养基上,大量的PdY3纵向排列在一起形成有序的束状群体结构。这些束状群体能够以整体的方式进行运动,而这一群体行为是依赖于同一个束状体中的每一个体的相互协调并朝着共同的方向运动。在液体培养基中,当PdY3与鱼腥藻共培养时,也表现出群体行为,能够形成三维网状结构。由于这种网状结构更有效地捕捉食物鱼腥藻,提高了直接接触的溶藻机率,从而大大加速了这一溶藻过程。上述PdY3独特的束状结构及其整体方式的协调运动、以及网状群体结构的溶藻行为均表明,PdY3的个体之间可能存在某种信息物质和严密的信息交流和传递机制。PdY3的溶藻范围分析表明,在固体培养基上对水华鱼腥藻Anabaenaflos-aquae245等丝状藻和组囊藻Anacystisnidulans242等单细胞藻等多种宿主发挥溶藻作用,但在液体培养中主要对水华鱼腥藻等丝状藻有效,这种对宿主的选择性可能与PdY3网状群体结构的溶藻行为相关。 同时,本文从水华污水中分离到两株感染和裂解窝型席藻Phormidiumfaveolarum239的蓝藻病毒,分别命名为P3和P4。其中,P4对窝型席藻239的感染和裂解能力很强,而P3较弱。以P4为主要研究对象,根据P4的形态结构和DNApolymerase的氨基酸序列等分析结果,P4属于短尾病毒科(Podoviridae),并对窝型席藻239具有严格的宿主专一性。在光照条件下,P4在窝型席藻239内的潜伏期和裂解期均为5h,释放量为145PFU/cell。但是在黑暗的条件下,P4不能裂解宿主细胞。同时在PEG浓缩P4的过程中,镁离子是维持P4的侵染/裂解活性所必须的。 为了进一步研究P4的宿主选择性及其溶藻的分子机制,对P4实施了全基因组测序。结果表明P4的基因组为线性双链DNA结构,全长40,938bp,带有107bp的正向末端重复序列。通过生物信息学软件,在P4基因组正反两条链中共预测到46个基因。这些基因的氨基酸序列的计算机辅助分析进而表明,共有13个可预测基因与已知病毒有较高的相似性,其中有6个预测基因检索到保守结构域。 通过P4在宿主体内的扩增、PEG浓缩、以及蔗糖密度梯度离心的纯化,得到P4纯病毒。将纯病毒颗粒进行SDS-PAGE分离,对病毒结构蛋白的各组份取样分别进行胰蛋白酶消化,并对质谱测定的肽指纹图谱进行软件分析,结果表明,由SDS-PAGE所显示的9个结构蛋白(1,2,3,4,5,6,7,8和9)中,7个蛋白(1,2,3,4,7,8和9)确定了在P4基因组中相对应的基因,而且它们都分布在同一条正链上。上述研究结果将对P4基因组的结构与功能,特别是对揭示蓝藻病毒P4的遗传与变异、宿主专一性识别机制及其溶藻机理打下了良好的基础。
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