论文部分内容阅读
第一部分：SSAT2基因真核表达载体的鉴定及其在肾癌Caki-1细胞中的表达目的：人精脒/精胺N1乙酰基转移酶2(Spermidine/spermineN1-Acetyltransferase2,SSAT2)基因真核表达载体pcDNA3.1(D)/V5-His-SSAT2的鉴定及其在肾癌Caki-1细胞中的表达。方法：SSAT2基因真核表达载体pcDNA3.1(D)/V5-His-SSAT2经KpnⅠ、XbaⅠ双酶切及测序鉴定，利用X-treme GENE HP转染试剂将其转入肾癌Caki-1细胞， Western blot鉴定带V5标签的SSAT2（V5-SSAT2）在细胞中的表达。结果：SSAT2真核表达质粒酶切后，切下5537bp和577bp片段,琼脂糖凝胶电泳显示与目的片段大小一致。对扩增的片段进行测序分析与Gene Bank报道相一致。Western blot证实转染组V5-SSAT2蛋白有表达。结论：pcDNA3.1(D)/V5-His-SSAT2片段插入正确，SSAT2基因成功转入肾癌Caki-1细胞。第二部分： SSAT2基因过表达在低氧条件下对肾癌Caki-1细胞增殖凋亡的影响目的：探讨在低氧条件下转染SSAT2基因对肾癌Caki-1细胞增殖凋亡的影响及其机制。方法： pcDNA3.1(D)/V5-His-SSAT2转染肾癌Caki-1细胞，在1%氧浓度下培养48小时，Western blot检测低氧诱导因子-lα(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)蛋白表达。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化；MTT法检测24h、48h、72h细胞的活力，流式细胞术检测细胞的凋亡率、死亡率。结果：与空白细胞组及空载体组比较，转染SSAT2细胞组HIF-1α表达明显下调（P<0.01）；同时转染SSAT2后细胞数量减少、细胞间连接减少，皱缩细胞数量增多；MTT结果显示，细胞培养24h即可观察到V5-SSAT2组细胞活力（0.238±0.027）较空载体组（0.283±0.017）及空白细胞组（0.292±0.021）降低，培养72h差异显著（P<0.01）；流式细胞术检测可见转染SSAT2组细胞死亡率（18.3±1.23）、凋亡率（7.39±2.71）较空载体组死亡率6.60±0.53）、凋亡率（5.72±1.57）增加，差异显著（P<0.05）。结论：转染SSAT2可能通过下调HIF-1α蛋白的表达抑制肾癌细胞的增殖，增加肾癌Caki-1细胞的死亡率、凋亡率。第三部分：SSAT2基因过表达在低氧条件下对肾癌Caki-1细胞化疗敏感性的影响目的：探讨在低氧条件下SSAT2基因过表达对肾癌Caki-1细胞化疗敏感性的影响。方法： pcDNA3.1(D)/V5-His-SSAT2转染肾癌Caki-1细胞，各组细胞分别加入0.125μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml阿霉素，0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml顺铂，细胞在1%氧浓度下培养48h，MTT检测各组细胞活力，计算抑制率。MTT法检测加入0.5μg/ml阿霉素或2.5μg/ml顺铂培养24h、48h、72h各组细胞活力，绘制细胞活力曲线。结果：各浓度阿霉素对V5-SSAT2组细胞的抑制率大于空载体组和空白细胞组，阿霉素浓度为0.5μg/ml时，转染组细胞抑制率为（52.7±9.6）%，而空白细胞和空载体细胞的抑制率为（39.5±8.9）%，（41.0±7.6）%，差异有统计学意义（P<0.01）；顺铂浓度为2.5μg/ml时，转染组细胞抑制率可达（40.1±3.4）%，空白细胞和空载体细胞的抑制率为（23.8±5.5）%，（29.3±5.4）%，差异有统计学意义（P<0.01）；分别加入0.5μg/ml阿霉素或2.5μg/ml顺铂培养至24h时，转染SSAT2组肾癌细胞增殖能力开始低于空载体组和空白细胞组，差异有统计学意义（P<0.05），48h时差异明显（P<0.01）。结论：转染SSAT2可增加肾癌Caki-1细胞对阿霉素和顺铂的化疗敏感性，降低肾癌对阿霉素和顺铂的耐药。