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每种蛋白均由特定基因编码,具有特定的生化特性。然而许多蛋白却呈现出多个等电点,不同的疏水性,且不同蛋白之间存在普遍的免疫交叉反应。 本实验室发现,一种富含苯丙氨酸的碱性短肽(BOP)以离子键和疏水作用结合在乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase,EC1.1.3.15,GO)等多种蛋白的表面,引起同一蛋白出现多个等电点、变化的疏水性,不同蛋白产生免疫交叉反应。BOP在电泳中可向负极泳动,改变多种蛋白的电泳行为。 BOP普遍而大量地存在于动植物和微生物体内,必定具有某种或多种生理功能,只是由于SDS电泳中向负极泳动而长期被忽略。GO以黄素单核苷酸(FMN)为辅酶,具有氧化乙醇酸生成乙醛酸的催化活性。本文以GO为研究材料,探索了与GO结合的BOP的生理功能。 GO与BOP结合,形成复合体(G0-BOPComplex,GC)。本文采用SDS-PAGE、免疫印迹、光谱测定、等电聚焦和活性测定等手段,对不同批次的GC以及酸处理后的GC进行特性分析,以确定BOP的生理功能。所得结果如下: 1)经过酸处理,GC中的BOP被全部或部分去除。酸处理去除BOP后的GC与处理前相比,GO活性消失或大幅下降,再加入含有BOP的上清后活性恢复;向GC中加入含有BOP的负极缓冲液,活性明显增强。证明了GO发挥活性需要BOP的存在,BOP可介导GO与FMN的结合。 2)多批GC光谱测定及免疫印迹出现不同的结果,表明BOP可分布在GO的不同部位,有时完全嵌入内部,有时有部分覆盖在表面;表面BOP含量的多少与GO活性无直接关系,说明介导GO与FMN结合的BOP在GO的内部。 3)吸收峰在280nm附近的GC,活性测定出现两种情况,一种不加FMN完全没有活性,加足量FMN后有高活性;另一种不加FMN即有活性,但不同GC不加FMN时活性差别很大,额外加入足量FMN后,活性均恢复;不加FMN即有活性的GC,在经过Sephadex G-25分子筛柱层析或酸处理后,需要额外添加FMN才有活性。说明GC只存在一种需要辅酶的形式。 4)免疫印迹和等电聚焦结果表明,吸收峰靠近280nm的无色GC,含有BOP。活性测定结果则表明,这类GC有时含有FMN。而光谱测定既测不到BOP的特征吸收峰,也测不到FMN的特征吸收峰,说明两者均结合在GO酶的内部。通过Sephadex G-25柱层析或酸处理将内部的BOP部分去除后,即使再加入过量的FMN,GO的活性也不能恢复。说明这些内部的GO介导GO与FMN的结合,BOP极可能将FMN定位于GO的活性中心。 5)在不同pH梯度下对几批GC进行活性测定,结果表明,GC的最适pH在7.8,该最适pH值可能与BOP和GO的结合有关。