论文部分内容阅读
POU基因家族编码一类重要的与神经系统发育相关的转录因子,其特征是含有高度保守的POU结构域(POUdomain),该结构域包括POU特异结构域、POU同源结构域和将二者连接在一起的一段保守性较低的连接区。表达模式和功能分析表明,POU家族转录因子在神经系统发育和功能形成中起关键性作用(Latchman,1999)。
根据POU结构域的保守性,以POU保守区序列的双链DNA为探针,从第五天鹌鹑全胚胎cDNA文库中筛选得到数个阳性克隆。序列测定和同源性分析表明,其中一个cDNA克隆的全长为1966bp,编码一个260个氨基酸残基的蛋白质,含有完整的POU特异结构域、连接区和POU同源结构域。该蛋白的POU结构域与哺乳动物的同源Brn-1蛋白完全一致,提示所筛选到的cDNA属于POUⅢ家族中的Brn-1亚类,所以将该基因命名为qBrn-1。该克隆是鸟类中筛选到的第一个Brn-1同源基因。令人感兴趣的是,由该cDNA编码的蛋白具有非常独特的N-端序列,暗示该基因在进化中可能发生了功能方面的改变。
通过原位杂交技术,作者详细分析了qBrn-1在鹌鹑早期胚胎发育过程中的表达模式,同时对另一鹌鹑POUⅢ家族基因qBrn-2也进行了表达模式的检测,并将二者进行了比较。尽管在其它物种中已知Brn-1和Brn-2在中枢神经系统中显著表达,但关于二者在神经系统早期发生过程中的动态表达模式还没有具体的对比描述。此外,作者还克隆、表达和纯化了qBrn-1蛋白的N-端片段,并以此肽段为抗原免疫新西兰白兔,获得了多克隆抗体anti-qBrn-1,通过蛋白印迹实验验证了该抗体的特异性。利用anti-qBrn-1,通过免疫组织化学技术,作者进一步检测了qBrn-1蛋白在鹌鹑早期胚胎发育过程中的表达,完善和确定了qBrn-1的组织定位。
从神经胚形成至器官发生,qBrn-1和qBrn-2都强烈的表达在中枢神经系统中,其转录本首先出现在神经板上,而后分布在神经管的各个区域,并且表达强度呈现出随胚胎发育时期而变化的动态模式。在中枢神经系统外的脊索和神经嵴也检测到qBrn-1和qBrn-2的表达。此外,与qBrn-2不同的是,qBrn-1的表达更为广泛,其信号还出现在耳窝、鳃弓和胚肾的中胚层衍生结构中,提示qBrn-1可能参与了耳朵、鳃弓衍生结构和肾的发育。根据qBrn-1和qBrn-2所具有的相互重叠而又各具特点的动态表达模式,作者猜测POUⅢ家族基因在神经发生和器官发生过程中具有多种功能。
有趣的是,通过原位杂交和免疫组化相互验证,结果显示qBrn-1的mRNA和蛋白在胚肾中起始表达的时期都比小鼠Brn-1基因早,而且表达区域也更广泛,暗示qBrn-1在肾发育中具有某些独特的作用。
此外,作者还构建、表达和纯化了qBrn-1的全长蛋白及其片段,为深入研究qBrn-1的结构和功能奠定了基础。