白芷来源为伞形科植物白芷Angelica dahurica (Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f.或杭白芷Angelica dahurica (Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f. var. formosana (Boiss) Shan et Yuan的干燥根,是一味常用中药。白芷主产于我国四川、浙江、河北、河南等省,根据以上产地,传统商品药材可分为川白芷、杭白芷、祁白芷和禹白芷。在川白芷规范化种植过程中,川白芷种子生产规范化严重滞后,川白芷种子质量优劣完全依靠当地药农的经验进行评价,普遍存在自繁自育现象,严重缺乏相应的法定标准规范川白芷种子质量,极不利于“有效、优质、稳定、可控”的川白芷药材的生产。在川白芷种子质量标准研究过程中,结合文献报道,我们发现不同产地白芷种子的品质有差异,且各地均有用劣质“公白芷”种子代替正常白芷种子售用的情况,但外观上无法区别,故白芷种子的鉴别研究是也是当务之急。本文针对川白芷种子的质量现状,研究了川白芷种子的质量检验方法和分级标准,并通过田间试验验证其科学性和合理性,为川白芷种子生产、流通、检验、使用提供规范的质量标准,为其它中药材种子质量标准的制定提供参考。进而采用形态组织学、化学、生物学等多学科的技术和方法,研究川白芷种子、公白芷种子、杭白芷种子、祁白芷种子和禹白芷种子之间的差异,为鉴别不同产地白芷种子及劣质白芷种子提供科学依据。研究结果如下：1 川白芷种子质量标准研究1.1 川白芷种子质量检验方法研究参考国际种子检验规程、 《农作物种子检验规程(GB/T3543-1995)》及中药材《种子标准平台课题考核目标及研究》,系统考察了川白芷种子各项指标的测定方法,以川白芷GAP基地所产的两批川白芷种子为材料,对种子扦样、净度分析、发芽试验、真实性鉴定、水分测定、生活力测定、重量测定、健康度测定等8个方面进行方法学研究,确定了适宜川白芷种子质量指标的检验方法：川白芷种子最少扦样量为12g；过20目筛后进行净度分析；真实性鉴定采用外观形态鉴定和大小测量；重量测定采用千粒法；种子置于砂上,光照12h,25℃/18℃昼夜变温,计数9-30d进行发芽试验;低恒温(105±2)℃烘干时间4h测定种子含水量；0.7%TTC溶液染色3h测定种子生活力；健康度测定直接将种子接种于PDA培养基上,28℃培养3d后观察计数。本研究为川白芷种子检验规程和分级标准的制定提供了理论依据。1.2川白芷种子分级标准研究本研究首次进行了川白芷种子几项指标的测算。采用本课题研究确定的川白芷种子检验方法,对所搜集的56份四川不同产区的川白芷种子进行了发芽率、千粒重、生活力、净度和含水量等指标的测定,利用K-均值聚类分析的数学分级原理,对相关数据进行了标准化处理,通过聚类分析,拟定了以发芽率和千粒重为主要指标.,生活力、净度和含水量为参考指标的5项指标3个等级的川白芷种子分级标准：Ⅰ等川白芷种子发芽率≥54.6%,千粒重≥3.48g,生活力≥69.2%,净度≥91.8%,含水量≤10%；Ⅱ等川白芷种子发芽率38.6%-54.6%,千粒重3.06g-3.48g,生活力55.7%～69.2%,净度84.6%-91.8%,含水量≤10%；Ⅲ等川白芷种子发芽率28.0%-38.6%,千粒重2.70g～3.06g,生活力45.0%-55.7%,净度75.0%-84.6%,含水量≤10%。经检验证明所制订的川白芷分级标准科学合理,为川白芷种子的质量控制提供了标准依据。1.3川白芷种子等级划分与植株生长发育及药材产质量的相关性研究本研究首次考察了川白芷种子等级划分与植株生长发育及药材产质量的相关性,弄清了川自芷分级与植株生长发育及药材产质量的变化规律。按本课题研究制订的川白芷种子分级标准,将川白芷种子三等：Ⅰ等、Ⅱ等、III等。以不同等级的川白芷种子和公白芷种子作为试验材料,采用大田种植法,跟踪测定并评价川白芷植株部分农艺性状指标及各营养器官鲜、干重等指标,及测算药材产量,测定药材香豆素和挥发油含量等指标,以此判断川白芷种子分级标准的科学性和合理性。实验结果表明,从植株生长发育来看,按照所指定的Ⅲ白芷种子分级标准分级的Ⅰ、Ⅱ等川白芷种子明显优于III等川白芷种子和公白芷种子。从药材产量来看,川白芷种子等级越高,越有利于药材增产；公白芷种子的药材产量过低,不适合生产用种。从药材质量来看,川白芷种子等级越高,越有利于增加药材中氧化前胡素和欧前胡素的量：不问等级川白芷种子对药材挥发油含量的影响不大。结果表明,本文制订的川白芷种子分级标准有具有一定的科学性、合理性。为指导优质川白芷药材生产提供了技术支撑。2不同产地白芷种子及公白芷种子鉴别研究2.1形态组织学对比研究首次进行了不同产地白芷种子及公白芷种子形态组织学对比研究,弄清了其形态组织学方面的差异,为白芷种子的鉴别提供了参考依据。对不同产地白芷种子及公白芷种子进行了性状鉴别和显微鉴别,主要观察分果形态,大小,颜色,表面特性,横切面油管分布情况,以及测算横切面油管相关指标等。研究结果表明,不同产地白芷和公白芷分果外观形态差异不大,但大小上稍有差别,以杭白芷和川白芷分果较长,祁白芷分果较短；川白芷和禹白芷分果较宽,杭白芷和毫白芷分果较窄,川白芷和禹白芷分果的种翅比例偏大,杭白芷和毫白芷分果的种翅比例偏小：川白芷分果和公白芷分果相比,川白芷分果长和宽均大于公白芷分果。不同产地白芷及公白芷分果横切面汕管差异较大,以杭白芷和禹白芷分果的各油管周长较长,面积较大,且比较饱满；川白芷分果的各油管周长较短,面积居中,饱满度适中；毫白芷分果的各油管周长较短,面积较小,饱满度适中；祁白芷分果背生面油管周长较短而合生面油管周长较长,背生面油管面积较小而合生面油管面积较大,各油管饱满度适中；川白芷分果横切面各油管的周长、面积和饱满度均大于公白芷。2.2化学成分对比研究本文首次进行了白芷种子香豆素类成分HPLC指纹图谱研究及挥发油类成分GC指纹图谱研究,并分析了不同产地白芷种子和劣质“公白芷”种子香豆素类成分和挥发油类成分的差异,为白芷种子的鉴别提供了化学成分方面的依据。2.2.1香豆素类成分的HPLC指纹图谱对比分析建立了白芷种子香豆素类成分HPLC指纹图谱,校正后得到了对照色谱中10个共有色谱峰。不同产地白芷种子及公白芷种子HPLC指纹图谱良好,由于产地不同,共有色谱峰的峰面积有差异。通过主成分和系统聚类分析,不同产地白芷种子及公白芷种子可以分为五类：川白芷种子,公白芷种子,杭白芷种子,禹白芷种子,祁白芷种子。2.2.2挥发油类成分的GC指纹图谱对比分析建立了白芷种子及公白芷种子挥发油类成分的GC指纹图谱,校正后的得到了对照色谱中27个共有色谱峰。不同产地白芷种子及公白芷种子GC指纹图谱良好,由于产地不同,共有色谱峰的峰面积有差异。通过对共有色谱峰的相对峰面积进行系统聚类分析,不同产地白芷种子及公白芷种子可以分为四类：公白芷种子为一类,禹白芷种子为一类,祁白芷种子为一类,川白芷种子和杭白芷种子为一类。不同产地白芷种子及公白芷种子挥发油GC-MS研究结果表明,白芷种子挥发油的主要成分为烯烃、烷烃、醇、酯和酮等,共鉴定出84种化合物。其中共鉴定出15利,共有成分。川白芷种子(SN2)鉴定出57种成分,约占总含量的54.67%,仅在川白芷种子中检出的3种成分。公白芷种子(SNG2)鉴定出32种成分,约占总含量的68.99%,仅在公白芷种子中检出的2种成分。杭白芷种子(PA4)鉴定出58种成分,约占总含量的66.26%,仅在杭白芷种子中检出的8种成分。祁白芷种子(AG2)鉴定出49种成分,约占总含量的46.66%,仅在祁白芷种子中检出的8种成分。禹白芷种子(YZ1)鉴定出50种成分,约占总含量的64.78%,仅在禹白芷种子中检出的2种成分。不同产地自芷种子及公自芷种子挥发汕主要成分的比较分析表明,g-杜松烯、2-蒈烯、环苜蓿烯和塞舌尔烯及其相对含量具有一定的特征性,可作为不同产地白芷种子及公白芷种子鉴别的参考依据。2.3蛋白质分析本文首次进行了不同产地白芷种子蛋白质SDS-PAGE指纹图谱研究,弄清了不同产地白芷种子蛋白质谱带的差异；并首次将TMz-TDS技术引入白芷种子的鉴别研究,弄清了不同产地白芷种子和劣质“公白芷”种子蛋白质在太赫兹波段的吸收差异。其研究结果为白芷种子的鉴别提供了蛋白学的依据。2.3.1蛋白质SDS-PAGE指纹图谱研究建立了不同产地白芷种子及公白芷种子蛋白质SDS-PAGE指纹图谱,川白芷种子有13条标准特征蛋白谱带,公白芷种子有11条标准特征蛋白谱带,杭白芷种子有17条标准特征蛋白谱带,祁白芷种子有16条标准特征蛋白谱带,禹白芷种子有16条标准特征蛋白谱带。对所有标准特征谱带进行相对定量,通过对标准特征谱带相对定量结果进行主成分和系统聚类分析,不同产地白芷种子及公白芷种子可以分为五类：川自芷种子,公自芷种子,禹白芷种子,祁白芷种子,杭白芷种子。2.3.2蛋白质太赫兹时域光谱(THz-TDS)初步研究不同产地白芷种子及公白芷种子的THz吸收谱中主要谱线位置主要在0.17THz、0.18 THz、0.22 THz、0.27 THz和13.28 THz,都处在太赫兹低频段。与其他种子相比,公白芷种子在0.29THz有特有吸收,可用于和其他白芷种子的鉴别；祁白芷种子在0.12THz、0.14THz和0.25THz有特有吸收。虽然川白芷种子和杭白芷种子的THz吸收位置基本相同,但杭白芷种子的吸收系数大于川白芷种子。