【摘 要】
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近些年来,利用基因密码子拓展技术,已经实现了超过230种非天然氨基酸（non-canonical amino acid,nc AA）在蛋白的定点插入。从而在蛋白质成像、结构鉴定、蛋白相互作用机理研究和蛋白功能调控等许多领域得到了广泛的应用。正交的氨酰tRNA合成酶（aminoacyl-tRNA synthetase,aaRS）是该技术实现的关键,它与非天然氨基酸之间的识别会显著影响插入的效率。其中
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近些年来,利用基因密码子拓展技术,已经实现了超过230种非天然氨基酸（non-canonical amino acid,nc AA）在蛋白的定点插入。从而在蛋白质成像、结构鉴定、蛋白相互作用机理研究和蛋白功能调控等许多领域得到了广泛的应用。正交的氨酰tRNA合成酶（aminoacyl-tRNA synthetase,aaRS）是该技术实现的关键,它与非天然氨基酸之间的识别会显著影响插入的效率。其中来自于古细菌詹氏甲烷球菌的酪氨酰tRNA合成酶（tyrosyl-tRNA synthetase,TyrRS）可用于在原核系统中插入nc AA,而改造后的大肠杆菌TyrRS可以在哺乳动物细胞中应用。但是广泛的研究都专注于tRNA与非天然氨基酸的整体氨酰化过程,使得aaRS与非天然氨基酸之间相互作用的研究比较少。为了研究上述两种TyrRS与不同氨基酸底物之间的亲和力大小和作用机理,本文构建并纯化了4个来源于大肠杆菌和詹氏甲烷球菌的野生型酪氨酰tRNA合成酶及其突变体。利用等温滴定量热法,测定了它们与酪氨酸、苯丙氨酸及另2种非天然氨基酸（3-碘-L-酪氨酸（3IY）和4-乙酰-L-苯丙氨酸（p Ac F））的相互作用力。通过滴定得到的热力学数据（焓变（ΔH）、熵变（ΔS）和平衡解离常数（Kd））,我们发现:具有相似结构的TyrRS对底物的亲和力（Kd）都在μM级别,且TyrRS对底物的特异性结合是一个放热过程并且主要由焓变驱动,如氢键的缔合和范德华力作用。而经过改造的大肠杆菌TyrRS可以结合带有大位阻侧链的3IY,同时有利焓变减少而熵变成为主要驱动力。这说明引入的突变减小了不利的构象变化并且增强了疏水作用,静电力可能是主要作用力。本文的研究从机理层面深化了氨酰化过程中TyrRS与氨基酸结合的认识,也展示了等温滴定量热仪不仅可以辅助蛋白的结构解析,也具有成为一种筛选正交aaRS工具的潜力,为以后计算机辅助改造或者从头设计高活性的aaRS提供了帮助。
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