在真核细胞中,基因表达是一个多种因子参与的、被精确偶联与协同的精密细胞活动,该过程受到多种蛋白及非蛋白层面的调控。近年来有许多研究表明,与基因组染色质结构相关的蛋白不但能够在转录水平调控转录起始,并且能够一定程度地参与mRNA翻译、维持mRNA稳定性、及蛋白质折叠和修饰调控。我们在前期针对酵母的数据分析中发现,酵母基因及其内含子是有一定规律的:第一,酵母全基因组只有4%的编码基因含有内含子,并且这些内含子几乎都是参与酵母生长发育调控的重要基因;第二,对于这4%的内含子而言,所在位置绝大多数靠近基因的上游,并且大部分基因只有一个内含子;第三,大多数酵母内含子的长度在50-200bp之间,即在长度上有较为显著的特征;第四,酵母基因大多数在5’ UTR区域有一个无核小体区(NucleosomeFreeResion),接下来从基因的5’端开始基因的核小体排布由强变弱。目前关于内含子剪切机制的研究,除了已经发现的一些传统剪切因子和参与剪切的修饰酶以外,虽然都提到了它和核小体、启动子有关,但是调节核小体排布的因子有很多种,修饰也有很多种,不同启动子所招募的蛋白因子也不同,这些研究没有具体找出是哪些蛋白参与到这其中的调节过程,因此,我们的课题旨在找出哪些参与调节转录和染色质结构的因子参与了内含子剪切的调节。并且我们计划从基因结构的角度去解释上述三个问题:为什么酵母基因不适合剪切下游内含子(内含子大多在上游)、为什么酵母基因不适合含有多个内含子、为什么含有内含子的基因都参与细胞的重要功能,是否他们的内含子参与基因表达调控。基于上述分析和实验室的研究背景和材料等原因,我们选择的目的基因是核糖蛋白36B(Yeast RPL36B)、以及拟南芥核糖蛋白36B(Arab RPL36B),我们分别将Arab RPL36B基因cDNA克隆下来到酵母里表达,它能够组装到核糖体并且有正常功能。我们将此Arab RPL36B cDNA作为原始克隆,在其中不同位置分别插入不同数量、位置的内含子。一系列的实验结果表明酵母细胞能够识别并剪切多个内含子、也能够剪切处于下游的内含子,但剪切效率较低,说明酵母并不适合剪切多个内含子或位于基因下游的内含子。除此之外,由于基因的启动子亦属于影响基因结构的重要因素,因此我们试图从启动子的角度证明不同启动子对不同内含子剪切的效率有着不同的影响。在实验设计中,我们将所有插入不同内含子的克隆的启动子换成ADH1基因的启动子,并通过半定量PCR、Spotting assay、Western blot等实验验证启动子对内含子剪切及基因表达的影响。实验证明换启动子后,目的基因内含子剪切效率确实发生了变化。接下来我们希望通过构建酵母cDNA文库,筛选一些有利于酵母剪切多个内含子以及下游内含子的因子,如果筛选得到的蛋白与染色质结构相关,那么将更好地帮助我们从机制上了解内含子的剪切调控及发掘更多酵母内含子的重要功能。