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叶锈菌(Pucciniatriticina)侵染小麦过程中,小麦常常发生过敏性反应(hypersensitive reaction,HR)来抵抗叶锈菌的侵害。HR形成初期,发生的重要变化之一就是氧化迸发。本实验室长期从事小麦抗病机制方面的研究,实验室前期构建了小麦受到叶锈菌侵染的SSH文库,通过ESTs序列分析,筛查到TaADOR(Triticum aestivum ascorbate-dependent oxidoreductase)基因,在不亲和组合后的早期显著上调表达,通过VIGS和RNAi技术发现TaADOR基因在H2O2的清除中发挥作用。在本项研究中,以小麦(Triticum aestivum L.)品种洛夫林10(简称L10)和两个叶锈菌生理小种作为研究对象,其中L10与叶锈菌小种260组成不亲和组合,L10和叶锈菌小种165组成亲和组合,借助已构建的小麦TaADOR基因的超表达和RNAi植物双元表达载体,利用小麦幼穗转化体系进行遗传转化,对TaADOR基因的T1代转化植株在组织水平及亚细胞水平上明确H2O2的分布变化规律;确定该基因在小麦抵抗叶锈菌侵染诱发HR时所起的作用,为进一步阐明TaADOR在小麦与叶锈菌的互作过程中的作用奠定基础。本研究主要获得以下结果:
1.通过生物信息学分析确定了TaADOR基因的理化特性及分子结构特征,小麦TaADOR为稳定的亲水性蛋白,无跨膜域,三维结构近似球形,在胞质中发挥作用。
2.对TaADOR-RNAi遗传转化阳性植株和超表达阳性植株的T1代小麦叶片接种叶锈菌生理小种260和165,通过DAB和HR染色,荧光显微观察发现叶锈菌侵染TaADOR-RNAi阳性植株在侵染点周围诱发的H2O2的积累要比转化空载体植株多,并且HR出现了扩展现象;叶锈菌侵染超表达阳性植株诱发的H2O2的积累要比转化空载体植株少,并且HR扩展面积比空载体植株小,表明TaADOR基因在叶锈菌与小麦互作过程中起到一定的清除H2O2的作用。
3.对TaADOR-RNAi遗传转化阳性植株和超表达阳性植株T1代分别接种叶锈菌生理小种260和165,侵染后不同时间点取样制作包埋块,利用CeCl3对H2O2标记,通过透射电子显微镜在亚细胞水平观察H2O2的分布。结果发现,超表达植株中侵染部位的CeCl3沉淀积累相对要少,而RNAi植株中CeCl3沉淀积累多,进一步表明TaADOR基因对H2O2有清除作用。
综上所述,TaADOR基因参与了细胞内H2O2的清除,并且初步表明TaADOR基因对小麦抵抗叶锈菌侵染诱发的HR有一定调控作用。
1.通过生物信息学分析确定了TaADOR基因的理化特性及分子结构特征,小麦TaADOR为稳定的亲水性蛋白,无跨膜域,三维结构近似球形,在胞质中发挥作用。
2.对TaADOR-RNAi遗传转化阳性植株和超表达阳性植株的T1代小麦叶片接种叶锈菌生理小种260和165,通过DAB和HR染色,荧光显微观察发现叶锈菌侵染TaADOR-RNAi阳性植株在侵染点周围诱发的H2O2的积累要比转化空载体植株多,并且HR出现了扩展现象;叶锈菌侵染超表达阳性植株诱发的H2O2的积累要比转化空载体植株少,并且HR扩展面积比空载体植株小,表明TaADOR基因在叶锈菌与小麦互作过程中起到一定的清除H2O2的作用。
3.对TaADOR-RNAi遗传转化阳性植株和超表达阳性植株T1代分别接种叶锈菌生理小种260和165,侵染后不同时间点取样制作包埋块,利用CeCl3对H2O2标记,通过透射电子显微镜在亚细胞水平观察H2O2的分布。结果发现,超表达植株中侵染部位的CeCl3沉淀积累相对要少,而RNAi植株中CeCl3沉淀积累多,进一步表明TaADOR基因对H2O2有清除作用。
综上所述,TaADOR基因参与了细胞内H2O2的清除,并且初步表明TaADOR基因对小麦抵抗叶锈菌侵染诱发的HR有一定调控作用。