宫颈癌是最常见的女性恶性肿瘤之一。虽然宫颈癌筛查的逐渐普及使越来越多的癌前病变与早期宫颈癌得到及时诊断与治疗,但宫颈癌的局部复发与远处转移仍是威胁女性生命的重要原因。目前宫颈癌的主要治疗方法是手术与放疗。由于宫颈癌的发病有年轻化趋势,对年轻患者的治疗需考虑其生活质量,如保留生育能力,对性生活的影响以及卵巢功能的保护等。手术范围扩大与术后辅助放疗对减少术后复发有一定意义,然而阴道长度缩短、放疗导致的并发症(阴道挛缩、阴道膀胱瘘、阴道直肠瘘等)严重影响患者生活质量,甚至影响患者家庭和睦。也使一部分年轻患者不愿接受放射治疗。然而以铂类为基础的化疗在宫颈癌辅助治疗中的效果一直不尽如人意,并且铂类耐药也是目前面临的一个重要问题。因此从天然化合物中寻找低毒、高效的抗癌药物迫在眉睫。槐耳为多孔菌科真菌槐栓菌的子实体,因常寄生于槐树树干上而得名,是一种传统中药,其抗癌功效于30年前才开始引起人们的关注。槐耳经热水两次提取得到槐耳清膏,经药理研究表明多糖是其主要活性成分。目前研究已证实槐耳清膏对肝癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤及卵巢癌等有抑制作用,并通过多种途径发挥作用,包括抑制肿瘤细胞生长；促进肿瘤细胞凋亡；抑制肿瘤血管形成;抑制肿瘤细胞上皮间质转化等。但槐耳清膏的抗肿瘤活性因细胞类型不同有很大差异,并且其作用机制也因不同细胞类型而有所不同。槐耳是否能抑制宫颈癌细胞的生长,国内外尚无报道。为研究槐耳清膏对宫颈癌的作用及机制,本课题内容主要包括以下三个方面。第一部分槐耳清膏对人宫颈癌细胞增殖能力的抑制作用研究背景和目的已有研究证实槐耳能明显抑制乳腺癌、肝癌、卵巢癌等恶性肿瘤细胞体外增殖能力。作用机制主要有促进细胞凋亡、促进细胞发生自噬、抑制细胞周期等。而槐耳对宫颈癌细胞的作用尚未见报道,因此本部分的研究目的为将不同浓度的槐耳清膏在体外作用于不同的宫颈癌细胞系,观察其对细胞的生长抑制作用并进一步探讨作用机制。研究方法本实验选取三种宫颈癌细胞系：C33A、SiHa、CaSki细胞。通过形态学观察、四唑盐比色法(MTT)、克隆形成实验分析槐耳清膏对宫颈癌细胞的抑制作用。并采用流式细胞仪检测细胞凋亡率与细胞周期。Western blot检测相关信号通路蛋白变化情况。研究结果1.槐耳清膏对宫颈癌细胞形态的影响分别采用梯度浓度槐耳清膏溶液处理宫颈癌细胞系C33A、SiHa与CaSki细胞,观察细胞生长状态与形态学变化。随着槐耳浓度的增加SiHa与CaSki细胞形态变化明显,表现为细胞皱缩、表面出现较多星状突起,甚至呈拉丝状。而C33A细胞形态变化不明显,只可见较多漂浮的死细胞。2.MTT法检测槐耳对宫颈癌细胞的抑制作用槐耳清膏对C33A、SiHa细胞具有抑制作用,并呈浓度、时间依赖性。槐耳清膏处理C33A、SiHa细胞48小时后的IC50分别为3.95 mg/ml与5.20 mg/ml,提示与SiHa细胞相比,C33A细胞对槐耳更敏感。槐耳清膏对CaSki细胞也有抑制作用,呈浓度依赖性,但随着时间变化其抑制作用无明显增强。并且低浓度槐耳(≤2mg/ml)对CaSki细胞抑制作用不明显。3.平板克隆实验检测槐耳对宫颈癌细胞的抑制作用用低浓度槐耳(0、1、2mg/ml)处理C33A与SiHa细胞后克隆形成的数目、大小均有降低,与对照组相比各组P值均<0.05。而在CaSki细胞中,Huaier浓度1 mg/ml时对细胞克隆无明显影响(292±16.97 versus 230±14.14, P=0.0580),当增加到2mg/ml时能明显抑制细胞克隆形成能力(292±16.97 versus 114±2.83, P=0.0046)。4.槐耳清膏对宫颈癌细胞周期的影响通过流式细胞术检测不同浓度的槐耳清膏(0、2、4、8mg/ml)对宫颈癌细胞周期的影响,发现C33A细胞经槐耳处理后出现G2/M期的积累。G2/M期细胞随着槐耳作用浓度升高而逐渐增多,槐耳浓度为4mg/ml、8mg/ml组分别与对照组相比差异有统计学意义,P值均<0.05。SiHa细胞与CaSki细胞经不同浓度槐耳清膏处理后各期细胞无明显变化,各实验组与对照组相比无显著性差异,P值均>0.05。5.槐耳清膏对宫颈癌细胞凋亡的影响用Annexin V-PI标记流式细胞术检测细胞凋亡情况,不同浓度槐耳清膏(0、2.4mg/ml)作用于SiHa与CaSki细胞,细胞凋亡率与对照组相比无明显差别,P值均>0.05。6.槐耳清膏抑制宫颈癌细胞增殖通过调节MAPK信号通路实现通过Western Blot方法研究槐耳清膏作用于宫颈癌细胞后MAPK信号通路相关蛋白的变化。C33A、SiHa细胞经槐耳清膏处理后,p-ERK蛋白表达水平呈下降趋势,而且呈时间、浓度依赖性。SiHa细胞在槐耳(8mg/ml)作用120分钟时p-ERK蛋白表达下降最明显,而C33A细胞在槐耳(8mg/ml)作用30分钟后明显下降,之后又缓慢回升。与经典的MAPK信号通路不同的是,在SiHa、C33A细胞中p-p38蛋白表达与p-ERK趋势不一致,均较对照组明显升高,并且呈浓度依赖性,而总的JNK、p38表达无明显变化。结论1.槐耳清膏对人宫颈癌细胞增殖能力有抑制作用。2.槐耳清膏可使人宫颈癌C33A细胞G2/M期阻滞。3.槐耳清膏抑制人宫颈癌C33A细胞与SiHa细胞增殖是通过激活p-JNK/p-p38途径实现的。第二部分槐耳清膏对人宫颈癌细胞迁移侵袭能力的抑制作用研究背景和目的宫颈癌术后局部复发和淋巴转移仍是患者不良预后的主要原因。文献报道槐耳可以抑制乳腺癌、肝癌、卵巢癌体外迁移、侵袭能力,在肝细胞癌裸鼠肺转移瘤生长方面也有抑制作用。槐耳对不同肿瘤的作用机制也各不相同,研究证实槐耳可以通过抑制肿瘤血管形成、抑制肿瘤细胞上皮-间质转化等途径发挥作用。槐耳是否能抑制宫颈癌的浸润转移,目前尚无这方面的报道。本部分实验的目的是研究槐耳是否对宫颈癌细胞迁移侵袭能力的产生一定影响,并进一步探讨其发挥作用的分子机制。研究方法本实验选取三种人宫颈癌细胞系：C33A、SiHa、CaSki细胞,选用低浓度槐耳清膏溶液(2mg/ml)作用于细胞,通过tranwell小室法计算穿膜贴壁的细胞数目以评估槐耳对细胞体外迁移、侵袭能力的影响。Western blot检测相关信号通路蛋白变化情况。研究结果1.槐耳清膏抑制宫颈癌细胞体外迁移能力。选取低浓度槐耳清膏溶液(2mg/ml)作用于不同的宫颈癌细胞C33A、SiHa与CaSki细胞。三种细胞的迁移能力均受到明显抑制,各实验组与对照组相比P值均<0.05。其中对CaSki细胞的作用最明显。2.槐耳清膏抑制宫颈癌细胞体外侵袭能力。选用SiHa细胞与CaSki细胞为研究对象。在低浓度槐耳清膏(2mg/ml)的作用下,SiHa细胞与CaSki细胞穿过基质胶的细胞数均明显减少,各实验组与对照组相比P值均<0.05。3.槐耳清膏对宫颈癌细胞体外侵袭能力的作用通过调节ERK/β-catenin信号通路实现用Western Blot方法检测宫颈癌细胞经槐耳处理后ERK/β-catenin信号通路相关蛋白的变化。用不同浓度的槐耳清膏(0、2、4、8mg/ml)作用于CaSki细胞4小时,磷酸化ERK蛋白(p-ERK)表达明显降低,并呈浓度依赖性,而总的ERK蛋白表达无明显变化。低浓度的槐耳清膏溶液(0、1、2、4mg/ml)作用于CaSki细胞72小时后,β-catenin蛋白表达明显降低,并且呈浓度依赖性。结论1.槐耳清膏可以抑制人宫颈癌细胞体外迁移、侵袭能力。2.槐耳清膏对人宫颈癌细胞体外侵袭能力的作用通过调节ERK/β-catenin信号通路实现。第三部分槐耳清膏对人宫颈癌细胞裸小鼠致瘤能力的抑制作用研究背景和目的体外细胞实验的优势是能控制环境因素,进行多次反复实验,各实验间误差较小,较为快捷和经济等。但肿瘤组织成分复杂,不是多个异常细胞简单组合形成。肿瘤细胞内多种不同成分细胞可以互相作用,互相影响,进而影响机体功能。而体外实验无法充分考虑与肿瘤密切相关的其他系统的因素,如免疫系统、神经内分泌系统的影响。而应用动物实验可以弥补体外实验的不足,更为深刻了解人类肿瘤发生发展规律,评价药物治疗效果,更接近临床应用。前两部分实验结果已证实槐耳清膏对宫颈癌细胞增殖、侵袭能力有明显抑制作用。本部分实验目的是探讨槐耳清膏对宫颈癌细胞裸鼠移植瘤的影响。研究方法本实验选取人宫颈癌细胞系SiHa细胞,接种于裸小鼠皮下。2天后将配制好的槐耳溶液100μl用灌胃针灌入每只裸小鼠胃内。对照组裸小鼠给予相同剂量的三蒸水灌胃。观察裸小鼠生活习性、体重变化,定期测量移植瘤大小,并用公式计算出肿瘤体积。研究结果1.两组裸小鼠体重与生活习性无明显差异。成瘤后两组裸小鼠均出现饮水增多,其精神状态、活动、饮食情况较前略差,但两组无明显差别。随着饲养时间延长两组裸小鼠体重略有增加,但差异无统计学意义。2.槐耳清膏抑制宫颈癌SiHa细胞裸鼠移植瘤的生长。用药停止1周后实验组肿瘤体积比对照组略有下降,直到停药4周后两组肿瘤体积才出现显著性差异,实验组明显小于对照组(实验组肿瘤体积88.71士66.97 mm3,对照组141.57±98.44 mm3,P=0.0093)。结论槐耳清膏可以抑制人宫颈癌细胞裸鼠移植瘤的生长。